人端粒酶催化亚基(hTERT)基因及其表达调控

端粒酶是一种核糖核蛋白复合物 ,能引起染色体的末端结构端粒的完全复制。端粒作为一种保护性结构 ,是由短的重复ＤＮＡ序列组成。在人体中这种序列为ＴＴＡＧＧＧ ,其平均长度为 5～ 1 5ｋｂ[1] ,细胞每经过一次分裂端粒缩短 50～ 2 0 0ｂｐ ,这种分子侵蚀作用使得细胞的分裂次数有了生理限制 ,从而限制了体细胞的寿命。一种逃避这种限制的机制是端粒酶的激活 ,因为端粒酶能弥补端粒的缩短 ,因此端粒酶被认为与细胞的永生化、肿瘤发生和细胞衰老密切相关。近来 ,组成人端粒酶复合物的 3个主要成分已被鉴定。人端粒酶ＲＮＡ成分 (ｈＴＲ)提…     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因第3内含子的克隆和分析

从端粒酶活性呈阳性的永生细胞株人肺腺癌细胞SPC A 1中分离了总RNA ,以此为模板 ,结合RT PCR技术和长模板PCR技术 ,用hTERT基因特异性引物扩增到一长约 2 .2kb的cDNA片段。将该片段纯化后克隆到通用测序载体T easyvector上得到重组质粒。用测序引物SP6和T7对该片段进行部分双向测序。经序列分析和同源比较推测该片段包含了hTERT基因的第 3内含子。该结果提示了RT PCR技术和长模板PCR技术用于真核生物基因内含子克隆的可行性。进一步的分析表明 ,该片段在不同细胞的RT PCR产物中的产量不同 ,提示hTERT基因前体mRNA中的第 3内含子可能在不同细胞中有不同的剪接效率。     

新型miRNA表达框架下调端粒酶活性并抑制视网膜母细胞瘤细胞生长

目的 本研究致力于设计一种新的miRNA表达框架（MEC）,其以hTERT和hTR的特异性序列为靶点。该框架能够有效改善传统RNAi方法中miRNA易降解和细胞毒性问题,为miRNA的合成提供一种简便的方法。方法 采用重叠PCR方法构建hTERT和hTR特异的miRNA表达框架。采用TRAP银染色和TRAP实时荧光定量PCR检测端粒酶活性。实时荧光定量PCR法测定端粒长度,MTT法测定细胞活力。annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡,PI单染色法检测细胞周期,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 成功构建了靶向hTERT/ hTR特异性miRNA表达框架。不同MEC对端粒酶活性的抑制程度不同。端粒酶的沉默可引起视网膜母细胞瘤（RB）细胞G0/G1期生长阻滞,导致细胞凋亡。结论 miRNA介导的端粒酶沉默是一种有效抑制RB细胞生长的策略,开发一个强大的系统来充分探索miRNA的作用是必要的。本文构建的MEC显示了强大的RNAi效应,可成为筛选用于RB基因治疗的RNAi靶向序列的有效工具。