SARS冠状病毒的分离培养与鉴定

采集急性期病人的咽拭子或漱口液,用Vero、Vero E6、MDCK、Hela、Hep-2等传代细胞,人胚肺二倍体细胞(HEL)和人胚肺(HP)细胞分离培养严重急性呼吸系统综合症(SARS)的病原体。结果用Vero、Vero E6、MDCK和HP细胞从标本中分离到一株病毒。间接免疫荧光试验发现,恢复期病人血清可与所分离的病毒起反应,在胞膜和胞浆中出现翠绿色荧光;中和试验结果表明,恢复期病人血清能中和病毒对细胞的致细胞病变作用;电镜下可观察到冠状病毒样颗粒;RT-PCR法可扩增到冠状病毒特异性基因片段,且其核苷酸序列与国内外发表的SARS冠状病毒(SARS-Cov)相应的基因序列相符,同源性达到100％。从传染性非典型肺炎病人的漱口液中分离到SARS冠状病毒,这种病毒与传染性非典型肺炎密切相关。     

SARS冠状病毒的分离培养与鉴定

采集急性期病人的咽拭子或漱口液,用Vero 、Vero E6、MDCK、Hela 、Hep-2等传代细胞,人胚肺二倍体细胞(HEL)和人胚肺(HP)细胞分离培养严重急性呼吸系统综合症(SARS)的病原体.结果用Vero、Vero E6、MDCK和HP细胞从标本中分离到一株病毒.间接免疫荧光试验发现,恢复期病人血清可与所分离的病毒起反应,在胞膜和胞浆中出现翠绿色荧光;中和试验结果表明,恢复期病人血清能中和病毒对细胞的致细胞病变作用;电镜下可观察到冠状病毒样颗粒;RT-PCR法可扩增到冠状病毒特异性基因片段,且其核苷酸序列与国内外发表的SARS冠状病毒(SARS-Cov)相应的基因序列相符,同源性达到100%.从传染性非典型肺炎病人的漱口液中分离到SARS冠状病毒,这种病毒与传染性非典型肺炎密切相关.     

广东省首例新型冠状病毒的分离与鉴定

2020年1月,广东省陆续从湖北省武汉市输入多例疑似新冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的病例,经检测为SARS-CoV-2核酸阳性的实验室确诊病例。为进一步了解SARS-CoV-2毒力,满足药物研发和疫情防控等需求,并建立SARS-CoV-2分离方法为后续研究打下基础,本研究使用Vero-E6细胞,选择一例经Real-time RT-PCR鉴定为SARS-CoV-2阳性的肺泡灌洗液进行接种,逐日观察,肺泡灌洗液接种的细胞管4d出现疑似细胞病变(Cytopathic effect,CPE),再进行第二代接种2d出现病变,提取核酸进行鉴定,为SARS-CoV-2阳性。经二代测序成功获得全基因组序列,进化分析结果显示本次分离的毒株为SARS-CoV-2。     

猪丁型冠状病毒HB-BD株的分离与鉴定

猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新的引起仔猪腹泻的冠状病毒,目前国内对PDCoV分离的研究较少。为从腹泻仔猪粪便及肠道内容物中分离鉴定PDCoV,本研究将RT-PCR检测为PDCoV病原阳性的腹泻样本,接种到ST细胞,进行病毒的分离传代。通过观察其细胞病变,RT-PCR和间接免疫荧光方法检测鉴定,并对分离株的S、M、N基因进行测序鉴定及序列分析。结果成功分离得到了PDCoV HB-BD株。经序列同源性分析发现,HB-BD分离株S、M和N基因与近年来国内外的流行毒株同源性很高,核苷酸同源性分别为95.8%～99.1%、98.6%～99.4%和97.8%～99.4%。进化树分析表明HB-BD分离株与中国毒株亲缘关系比其他国家近,处于同一分支。结果证实从腹泻仔猪的肠道内容物中分离并鉴定得到了一株猪丁型冠状病毒,本研究为后续分离株的致病性及生物学特性研究奠定了基础。     

浙江省SARS冠状病毒分离与系统进化树分析

从浙江省3例SARS患者中收集含漱液标本,经处理后接种Vero、RD、VeroE6和Hep-2细胞进行病毒分离,培养3d后在Vero和RD细胞中可观察到细胞病变。从细胞培养上清中提取病毒核酸,用SARS冠状病毒特异性引物进行RT-PCR,并经测序证实从3份临床样本中分离到2株SARS冠状病毒株。对其中1株病毒的基因组进行了全序列测定并作系统进化树分析显示浙汀省SARS冠状病毒株与新加坡2774株和台湾TW1株最为接近。     

在传染性非典型肺炎患者组织和血液中发现冠状病毒

用RT-PCR从广东两例传染性非典型肺炎(非典型肺炎)死亡病例的肺和脾标本中,以及北京、辽宁和宁夏非典型肺炎患者血清中,扩增出冠状病毒核苷酸序列。这些PCR产物为冠状病毒RNA聚合酶基因部分片段,所有测定的序列和国内外SARS病毒序列相同。这些发现提示,冠状病毒和非典型肺炎关系密切,有助于确定我国非典型肺炎的病因。所建立的套式PCR方法可以用于检测临床标本。由于血液中存在SARS病毒,进行血清操作时需要注意安全保护。     

一株马冠状病毒的分离鉴定及遗传演化分析

马冠状病毒病是由马冠状病毒(equine coronavirus, ECoV)引起的一种马新发胃肠道病毒病,成年马感染后主要出现发烧、腹痛和腹泻等症状。1975年,马冠状病毒感染首次在美国出现,此后在多个国家和地区均有流行,此前我国仅从山东腹泻驴的小肠样品中分离得到了一株重组马冠状病毒。【目的】了解ECoV中国毒株的基因组成、亲缘关系以及生物学特性,可以为我国ECoV流行现状和遗传演化趋势提供依据,为ECoV防控产品的研发提供材料。【方法】对湖北省武汉市黄陂区腹泻马匹的粪便样品进行RT-PCR检测,对检测阳性样品进行病毒分离,并利用靶向ECoV S1蛋白的单克隆抗体通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)对分离的病毒进行验证。根据ECoV-JL株全基因组测序结果,对全基因组、N基因和NS2基因进行了基因组系统发育分析和同源性比较。【结果】成功分离到一株ECoV,并命名为ECoV-JL。透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察分离到的病毒颗粒呈球状,且具有囊膜和冠状病毒典型的纤突结构。该分离株感染HRT-18细胞72 h后病毒滴度可到达峰值,半数组织培养感染剂量(tissue culture infectious dose 50%, TCID₅₀)约为10^6.16 TCID₅₀/mL。ECoV-JL毒株可以在人回盲肠癌(human ileocecal cancer-18, HRT-18)细胞、人结直肠腺癌(human colorectal adenocarcinoma-2, Caco-2)细胞和人肝癌(human liver cancer cells, Huh7)细胞上稳定传代。ECoV-JL株与GenBank中现有的ECoV全基因组序列相似性为97.9%-99.0%,系统发育分析发现ECoV-JL株属于单独的演化分支,与其他毒株的亲缘关系较远,说明ECoV-JL株可能是重组变异而来,其中NS2基因突变较多,NS2基因编码的差异是造成ECoV-JL株与其他毒株同源性较差的主要原因。【结论】本研究从腹泻马的粪便样品中成功分离并鉴定了一株ECoV,将其命名为ECoV-JL株,对该毒株生物学特性和亲缘关系的研究反映了湖北地区流行毒株的特点,为我国ECoV流行现状和演化趋势提供重要依据。     

SARS冠状病毒分离培养和鉴定的实验研究

建立严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒分离、培养方法,为SARS冠状病毒动物模型的建立提供实验依据,并根据病毒在体内存活的时间确定检测指标。选用已鉴定为SARS冠状病毒的毒株,经过鼻腔接种感染恒河猴。定期采集咽拭子标本,分离血清或血浆,用Vero细胞进行病毒培养、分离。结果显示,在SARS冠状病毒感染恒河猴后2、5、7天,可以从拭子中分离到病毒,5～15天可在猴肺、脾、肝、肾和淋巴组织中分离到病毒,并用免疫荧光法和RT-PCR方法进行了确定。首次实验证实了SARS冠状病毒可在恒河猴体内复制。SARS病毒的成功分离是SARS冠状病毒动物模型建立的主要依据,在进行疫苗安全性和药效评价等工作中,病毒分离可作为药物筛选、疫苗评价的重要指标。     

安徽省新型冠状病毒分离鉴定和全基因组序列分析

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)作为引起全球新型冠状病毒肺炎疫情蔓延的病原体而受到广泛关注。安徽省自2020年1月起陆续出现990例新型冠状病毒肺炎确诊病例。为探索SARS-CoV-2分离培养和二代测序方法构建,了解该病毒在安徽省传播的变异情况,为药物筛选和疫苗研发等工作提供基础和依据,本研究选取1例新型冠状病毒肺炎确诊病例咽拭子样本接种Vero细胞进行病毒分离培养,并逐日观察细胞病变,经荧光定量PCR检测确认病毒分离培养结果;采用SARS-CoV-2全基因组捕获技术及二代测序对毒株进行全基因组测序,并通过DNASTAR Lasergene MegAlign v7.1.0和PhyloSuite v1.2.1进行序列比对和进化分析;将全基因组序列上传国家基因组科学数据中心鉴定变异位点。结果显示,样本接种Vero细胞第4d出现细胞病变,经荧光定量PCR检测确认为SARS-CoV-2毒株。该毒株基因组序列全长29 860bp,与SARS-CoV-2参比序列相似度均在99%以上,共有9个位点发生突变。与蝙蝠来源SARS样冠状病毒Bat Yunnan RaTG13相似度最高,为96.8%。本...     

一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析

从江西南昌患出血病草鱼体内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09-01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK 细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量病毒聚集, 形态和排列方式与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)相似。针对GCRV 873 株S6 基因设计的简并引物可以从病料组织和感染细胞中扩增出目的条带, 而针对GCRVHZ08 株S6 基因设计特异性引物未能扩增出目的条带。对JX09-01 株的S6 全基因进行序列分析表明, 其核苷酸序列同GCRV 873 株和HZ08 株的同源性分别是99.3%和30.4%, 推导出的氨基酸序列同源性分别是98.6%和30%, 说明草鱼病毒JX09-01 株为草鱼呼肠孤病毒。用JX09-01 株接种当年8-10 cm左右的草鱼, 没有明显的临床症状, 不能致草鱼死亡。用传代至15 代的CIK 细胞病毒液进行免疫保护试验, 结果显示其对强毒株的免疫保护率达到86.7%。实验结果初步显示, 新分离到的JX09-01 为草鱼呼肠孤病毒弱毒株, 可作为弱毒疫苗的候选毒株。     

一株牛源阿卡斑病毒的分离鉴定

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)是能引起牛、绵羊、山羊流产、早产、新生胎儿畸形的虫媒性RNA病毒。为了解家畜虫媒病毒在我国西南边境地区的分布和流行情况,本研究对中缅边境西盟县的52份牛抗凝血和140份血清(牛70份、羊70份)中的蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、AKV等虫媒病毒进行检测与分离,通过ELISA及qRT-PCR方法检测病毒,通过核酸阳性抗凝血接种BHK细胞传代以分离病毒,通过设计特异性引物,扩增分离毒株S基因721bp片段及M基因816bp片段,通过克隆测序及中和试验以鉴定病毒,最终从38号牛的抗凝血中分离到一株AKV,TCID50为10-3.5/0.1mL,经比对,分离株S片段与日本KS-2/Mo/06毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为97.66%,M片段与中国DHL10M110毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为96.56%。本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到AKV,证实了西南边境存在AKV的流行,为AKV在我国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。     

牛源流行性出血病病毒(EHDV)血清10型毒株在我国的分离鉴定

我国存在多种血清型流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)的流行,但尚未有关于EHDV-10型毒株的分离报道。为了解云南省EHDV的流行情况,2012～2015年,本研究在云南省设立江城、师宗、芒市三个监控点,定期采集监控动物血液,接种幼仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)进行病毒分离;通过PCR检测、血清中和试验、琼脂糖凝胶电泳和电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定;对分离毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3基因节段进行克隆、测序与序列分析。2013年在云南省师宗县的哨兵牛上分离出一株EHDV毒株(YNSZ-V277-2013),病毒可引起BHK-21细胞出现圆缩、裂解的细胞病变(Cytopathic effect,CPE);电镜下病毒粒子呈球形,无囊膜,表面有大量纤维突,直径在70～80nm之间;病毒基因组dsRNA的琼脂糖凝胶电泳显示分离毒株与其他血清型EHDV一致,呈现"3-3-3"的电泳带型;序列分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3序列与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)相似度最高,分别为97.5%/98.5%与98.1%/99.8%,证实分离毒株为EHDV-10型;系统发育分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)的亲缘关系最近,Seg-3与分离至日本和澳大利亚的EHDV毒株同属Eastern型。本研究首次报道了EHDV-10型毒株在我国的分离以及分离毒株的Seg-2与Seg-3基因序列特征,为进一步开展中国EHDV-10型的流行病学调查与致病性研究提供了基础。     

一株恒河猴克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）的分离鉴定及序列分析

目的对恒河猴粪便中分离到的一株克罗诺杆菌进行鉴定,为实验恒河猴疾病检测、鉴别诊断和治疗提供参考依据j方法通过细菌培养特性、菌落形态观察及微生物鉴定系统（ID32E）生化试验进行菌落鉴定;并进行抗生素敏感试验和小白鼠致病性试验;用PCR方法扩增分离菌株的23SrRNA基因并测序,并将其与GenBank上参考菌株23SrRNA基因核苷酸序列进行同源性分析。结果经细菌形态学和生化鉴定该细菌为克罗诺杆菌,23SrRNA基因序列与GenBank中分离自婴幼儿配方奶粉中的阪崎克罗诺杆菌（CP004091）同源性为98％。药敏试验表明该菌对甲硝哒唑耐药,对其他15种抗生素敏感。致病性试验证明该分离菌株对小白鼠有强致病性。结论该株从恒河猴中分离到的克罗诺杆菌具有较强的致病性,对实验恒河猴饲养及相关研究人员有潜在的危害,因此,在恒河猴饲养及研究过程中应引起重视。头孢、庆大霉素和诺氟沙星等药物可作为治疗恒河猴克罗诺杆菌感染的临床用药。     

猪流感病毒分离鉴定

用非免疫鸡胚从我国上海、福建、湖北分离到3株猪流感病毒,分别命名为SSH1、SFJ1和SHB1。SIV分离株第5代病毒液对0．7％豚鼠红细胞的血凝活性分别1：2^8、1：2^7和1：2^8,与H3亚型标准血清血凝抑制价1：2^8、1：2^7和1：2^8,但不能被鸡新城疫阳性血清所抑制。纯化的病毒在电镜下观察,可见到猪流感典型的病毒粒子。病毒液接种于小白鼠,可表现出临床症状,剖杀后可观察到病毒性肺炎。猪体回归试验,可表现出临床症状和病理变化,从肺脏中可分离到病毒并且RT-PCR也可检测到病毒相应的基因片段。从纯化的病毒中提取RNA,进行RT-PCR,可扩增出预期的条带。     

欧洲黑杨MARs的分离克隆及序列分析

为获得林木植物核基质附着区(MARs)序列,诱导欧洲黑杨(Populus nigra)愈伤组织并制备悬浮细胞,裂解释放细胞核,除去非MARs的游离DNA片段,得到核基质。碱性缓冲液分离残留DNA与结合蛋白,回收并克隆残留DNA,测序后得到两个具有MARs序列特征的DNA片段A7和A23。序列特征分析结果表明它们都含有MARs的特征基元,通过与其他已发表的MARs序列比较,认为是从杨树中分离到的两个MARs片段,并预测了其功能。该研究是首次从木本植物获得MARs序列。     

虎源猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定

利用细胞培养方法从中国某虎园送检的腹泻虎肠内容物中分离出1 株细小病毒(TPV/ HT - 69),经系统的形态学、理化学、血清学试验、人工感染试验、PCR 扩增和VP2 基因序列分析,符合猫泛白细胞减少症病毒特征,证明该毒株为猫泛白细胞减少症病毒强毒。     

耐氧双歧杆菌的分离和鉴定

从中年人粪便中分离到136株可疑双歧杆菌,通过耐氧力测定获得一株耐氧性菌.经属和种的系统生理生化鉴定,确认为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum).小范围饮用实验结果表明,该菌对便秘有疗效.     

131 例住院肺炎患儿细菌感染现况及耐药谱分析

目的:分析住院肺炎患儿的病原菌分布及其耐药性。方法:选择2009年6月至2010年5月,新疆维吾尔自治区人民医院儿科住院的791例肺炎患儿,采取下呼吸道痰液标本,进行细菌培养及药敏试验。结果:16.56%(131/791)患儿被确诊为细菌性肺炎并且有明确的病原,其中,革兰阴性菌感染为75.57%(99/131),且以肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌多见;革兰阳性菌感染为21.37%(28/131),以肺炎链球菌多见;真菌感染为6.87%(9/131),均为白色假丝酵母;9.92%(13/131)的患儿存在两种及以两种上病原菌感染。鲍曼不动杆菌和肠杆菌对头孢类抗生素耐药严重,部分肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌产β-内酰胺酶(BLA),葡萄球菌属耐青霉素G,肠球菌对氯洁霉素、红霉素和复方新诺明耐药率100%,而肺炎链球菌对红霉素耐药率100%。真菌对常用抗菌药的耐药率为0。结论:我院住院肺炎患儿细菌性为16.56%。病原菌构成以革兰阴性菌为主,并且大多数病原菌耐药。临床应根据痰液细菌培养和药敏结果,合理选择抗菌药物,以减少细菌耐药性,防止滥用抗生素。