姜老师信箱

蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您蛋白质研讨班的学员,最近在纯化方面遇到了一点问题,想向您请教。我在做第一步纯化时,目的蛋白的活性总是很好,无论是用阴阳离子柱还是凝胶柱,都能获得很好的活性洗脱组分。但是到了第二步纯化,不管是离     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我第十九期蛋白质分离纯化研讨班的学员。上课时您讲到渗透压冲击法破碎大肠杆菌比超声破碎可以降低1个数量级的杂蛋白,我有以下几个问题请教:1.使用这种方法如何区分是包涵体还是可溶性表达,是否跟超声破碎一样:破碎菌体后离心,分别取上清和沉淀跑SDS-PAGE?2.这种方法对包涵体表达是否适用?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您蛋白质分离纯化技术专题研讨班的学员,有问题想向您请教。我在做蛋白的原核表达,用的是pkk223-3载体,表达菌株用了大肠杆菌JM109和TB1,发现表达蛋白均在包涵体中,降低IPTG浓度为0.05mM,降低诱导     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想向您咨询一些蛋白质纯化问题。1.细胞破碎。我按照您的讲义内容进行低渗冲击(先等渗氯化钠、高渗葡萄糖,最后低渗溶液冰浴离心),破碎后蛋白浓度还可以,但有可能是我的细胞样品低温冻存的缘故,加入等渗氯化钠后就出现细胞破碎,上清就有蛋白了。这样损失很     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我对蛋白纯化和大规模生产使用的纯化技术很有兴趣,有几个问题想向您请教:1.蛋白质复合物在生命体中是可溶状态吗?如果提取出体外,分子量较大的蛋白复合物(大于5000kDa)能以溶解状态存在吗?如果是胶体形式,会沉淀下来还是类似于悬浮液?(假定在pH7的水溶液中)     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班的学员,想请教您几个问题。我想用细胞培养的上清进行SDS电泳,但是总做不好,怀疑是上清中白蛋白含量较高。请问:细胞培养上清中会有白蛋白吗?如果有会影响SDS电泳吗?如果会影响,怎样把我的目的蛋白纯化出来,或者把白蛋白除去(我的目的蛋白大小是17kDa和34kDa)?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是第七期蛋白质分离纯化技术专题研讨班学员,我用强阴离子交换柱在HPLC上分离蛋白质时遇到了重现性方面的问题,恳请您赐教!蛋白性质:pI=4.7,Mw=28642,细菌来源,镍柱纯化。     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,向您请教样品洗脱的问题。样品之前在0-1.5mol/L氯化钠条件下无法洗脱,按照您讲的将洗脱液浓度提高到3mol/L(浓度依次是0.15、0.5、1、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0),除了0.15是10ml,其它的浓度洗脱了5ml,流速是0.75ml/min,出现梯度先升然后降的情况,在40-50min之间,只是洗下来一个小峰,样品峰未在梯度洗脱时出现。130min以后用1mol/L的NaCl加0.     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第9和16期蛋白质分离纯化技术专题研讨班的学员,想向您请教几个问题。在我的实验中,双水相处理之后,蛋白质在上相,其中可能混有PEG和盐,体积也较大(大于上柱体积)。请问在上柱之前用什么方法浓缩好呢?因为PEG存在时超滤浓缩很难进行,是用透析和超滤,还是进一步用(NH4)     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的\"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班\"学员,向您请教关于乳酸菌发酵液中分离小分子生物活性物质的问题。活性物质目前未知,初步猜测可能为环二肽,手性未知。我们合成后未检测到生物活性,所以需要重新进行分离纯化。     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,做抗菌肽等小分子多肽研究,向您请教包涵体的变性和增溶问题。我将线性抗菌肽串联在大肠杆菌中表达,用甲酸把串联的多肽裂解开,结果串联多肽以包涵体形式表达,甲酸也未能切开串联多肽。我又改用胃蛋白酶消化,但消化效果不好。现在准备用0.5MNaCl、10%乙醇、3%～5%PEG4000配合煮沸来使包涵体变性增溶,     

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正蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是2016年第20期蛋白质分离纯化技术专题研讨会的学员,想请教您关于肽分离的问题。我们有一种植物源物料(含干物质10%~20%,体量很大,),里面的干物质组分包含:1大于40%粗蛋白(游离氨基酸近三分之一、其余以肽类物质为主,且小分子肽居多)、2约20%的可溶性灰分(如钾钙镁等阳离子、磷酸盐类等阴离子)、3     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我想针对双水相分离细胞碎片和蛋白质这方面请教您几个问题。我看您的讲义中写道:用双水相从细胞碎片中抽提蛋白由于经济原因一般要选用盐-PEG系统。我的问题是:1、您讲过细胞碎片会分配到下相中是因为PEG排斥细胞碎片,那么其中的原理是什么?2、我们的蛋白是大肠杆菌表达的,先用低浓度的Tris缓冲液进行破菌,之后向破菌液中加入固体盐和PEG使之达到相应的浓度,搅拌溶解后室温静置成相。发现成相速度较慢,盐-PEG系统成相后,上相是富含PEG的相,这使得上相的粘度     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,想向您请教一下我在实验中遇到的问题。我的色谱图中可以明显看到几个相对独立的峰,但是在SDS-PAGE图中,150 kDa附近自始至终都出现条带;并且Fr.61-130和Fr.131-172两个峰的蛋白组成并没有太大差别,为什么还会分成两个不同的紫外吸收峰呢?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我有个实验问题向您请教。我的目的蛋白质应该是碱性,但使用一般的阳离子交换介质都是流穿,只有使用很强的阳离子交换介质,流穿不再有活性,但柱上活性回收很低。ELISA检测发现需要用NaOH洗脱主要部分,洗脱后测不到生物学活性。请问这是什么情况?该如何解决?谢谢您!     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我在蛋白质分离纯化方面有两个问题想向您请教:1、工厂规模化生产蛋白(分子量约为15kDa),除了采用各种层析方式外,一般还可以用什么方法来对蛋白质进行浓缩?与实验室规模的蛋白纯化相比是否有不同之处?