姜老师信箱

<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想向您咨询一些蛋白质纯化问题。1.细胞破碎。我按照您的讲义内容进行低渗冲击(先等渗氯化钠、高渗葡萄糖,最后低渗溶液冰浴离心),破碎后蛋白浓度还可以,但有可能是我的细胞样品低温冻存的缘故,加入等渗氯化钠后就出现细胞破碎,上清就有蛋白了。这样损失很     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我在蛋白质分离纯化方面有两个问题想向您请教:1、工厂规模化生产蛋白(分子量约为15kDa),除了采用各种层析方式外,一般还可以用什么方法来对蛋白质进行浓缩?与实验室规模的蛋白纯化相比是否有不同之处?     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,在上课时听您讲过用Protein A纯化单克隆抗体的效果并不完美,请问这是不是由于纯化后抗体容易形成二聚体或多聚体,而导致活性下降?我还想请教一下:1.如果只     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第9和16期"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想向您请教几个问题。在我的实验中,双水相处理之后,蛋白质在上相,其中可能混有PEG和盐,体积也较大(大于上柱体积)。请问在上柱之前用什么方法浓缩好呢?因为PEG存在时超滤浓缩很难进行,是用透析和超滤,还是进一步用(NH4)     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,有问题想向您请教。我在做蛋白的原核表达,用的是pkk223-3载体,表达菌株用了大肠杆菌JM109和TB1,发现表达蛋白均在包涵体中,降低IPTG浓度为0.05mM,降低诱导     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第13期"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想请教您几个问题。我想用细胞培养的上清进行SDS电泳,但是总做不好,怀疑是上清中白蛋白含量较高。请问:细胞培养上清中会有白蛋白吗?如果有会影响SDS电泳吗?如果会影响,怎样把我的目的蛋白纯化出来,或者把白蛋白除去(我的目的蛋白大小是17kDa和34kDa)?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,在纯化一个糖蛋白,使用的是单抗与CNBr结合后的亲和层析,洗脱是0.1M甘氨酸,盐酸调节pH至2.5,样品用含有巯基乙醇的5×上样缓冲液煮沸十分钟,但结果显示分子量增加了很多,由36KD左右到了60KD。想向您请教原因。非常感谢!姜老师答:     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您蛋白质研讨班的学员,最近在纯化方面遇到了一点问题,想向您请教。我在做第一步纯化时,目的蛋白的活性总是很好,无论是用阴阳离子柱还是凝胶柱,都能获得很好的活性洗脱组分。但是到了第二步纯化,不管是离     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第十七期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,将要进行MBP融合蛋白纯化,向您请教几个问题:(1)哪家公司的直链淀粉树脂好?(2)纯化过程中有什么需要特别注意的问题?(3)Tris-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液哪个好?pH值影响大吗?为什么不同标签用不同裂解缓冲液?非常感谢!姜老师答:学员你好。     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第9期和第16期"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,有问题想请教您。(1)我的目标蛋白大小约66kDa,在pET24a,BL21中有可溶性表达(提取时已加了PMSF,DNasI和少量Triton-X-100,3ul/60ml buffer),但是总得不到全长蛋白。(2)过Ni柱纯化不是很好。用50mmol/L咪唑也可以得到一些蛋白,但过Superdex 200后峰不尖,SDS-PAGE只能得到     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,向您请教关于乳酸菌发酵液中分离小分子生物活性物质的问题。活性物质目前未知,初步猜测可能为环二肽,手性未知。我们合成后未检测到生物活性,所以需要重新进行分离纯化。     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是第15期蛋白质分离纯化技术专题研讨班学员,想请教您有关凝血酶酶切的问题。我用pGEX-4T-1载体可溶性表达了HPV18 L1蛋白。由于菌体上清中有分子伴侣GroEL存在,在进行GST纯化前,先后加入5mmol/L ATP、10mmol/L MgCl2、150mmol/L KCl、20%甘油和3.5mol/L尿素去除伴侣,13 000r/min、4℃离心75min。将菌体上清直接进行GST纯化,用含有3mmol/L DTT、0.2mol/L Nacl、1mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris pH 8.0溶液洗去杂     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,您的授课让我获益良多。学习期间我曾向您请教过用NHS柱偶联抗原来纯化多克隆抗体的问题。关于偶联抗原蛋白量的计算,NHS柱商品说明书上显示配体密度为16-23μmol/ml干介质(ligand density:16-23μmol/ml drained medium),我使用的抗原分子量约为     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,想向您请教一下我在实验中遇到的问题。我的色谱图中可以明显看到几个相对独立的峰,但是在SDS-PAGE图中,150 kDa附近自始至终都出现条带;并且Fr.61-130和Fr.131-172两个峰的蛋白组成并没有太大差别,为什么还会分成两个不同的紫外吸收峰呢?     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是蛋白质研讨班的学员,我的课题是纤维素酶,上您的课收获很大,因为发现自己有好几步实验都做的不正确。在此我想咨询您几个问题:1.我只需要将纤维素酶脱盐、脱水浓缩,选用硫酸铵沉淀,之后透析的方法是否正确?有没有更好的方法?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是第七期蛋白质分离纯化技术专题研讨班学员,我用强阴离子交换柱在HPLC上分离蛋白质时遇到了重现性方面的问题,恳请您赐教!蛋白性质:pI=4.7,Mw=28642,细菌来源,镍柱纯化。     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员。我们准备用溴化氰活化介质偶联α-银环蛇毒素装柱,溴化氰活化的琼脂糖4B是某知名公司的,空柱还没定,说明书上推荐的是HR 16/10。请问这款柱子我们可以用吗?急切盼望您的回复,谢谢!     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第14期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,现在正在做有关茶叶、苹果等多酚氧化酶(PPO)分离纯化的实验,目的是为了得到PPO的纯品。目前我遇到一些困难,希望得到您的指点。我分离纯化PPO是通过匀浆、硫酸铵沉淀、DE-52阴离子交换柱、冻干进行的,我的问题如下:1.硫酸铵沉淀后的酶液,透析多久较合适?2.将酶液上样后,是     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我对蛋白纯化和大规模生产使用的纯化技术很有兴趣,有几个问题想向您请教:1.蛋白质复合物在生命体中是可溶状态吗?如果提取出体外,分子量较大的蛋白复合物(大于5000kDa)能以溶解状态存在吗?如果是胶体形式,会沉淀下来还是类似于悬浮液?(假定在pH7的水溶液中)     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我第十九期蛋白质分离纯化研讨班的学员。上课时您讲到渗透压冲击法破碎大肠杆菌比超声破碎可以降低1个数量级的杂蛋白,我有以下几个问题请教:1.使用这种方法如何区分是包涵体还是可溶性表达,是否跟超声破碎一样:破碎菌体后离心,分别取上清和沉淀跑SDS-PAGE?2.这种方法对包涵体表达是否适用?