稀有鮈鲫对草鱼出血病病毒敏感性的初步研究

本文报道稀有鲫对草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）的敏感性。ＧＣＨＶ是草鱼出血病的病原,用ＧＣＨＶ人工感好１－６月龄的稀有鲫,在水温２２－３２℃时能导致稀有鲫出现出血病症状。在水温２８℃时,病鱼在ｌｄ内死亡,潜伏期为５ｄ,发病高峰期在感染后第６－８ｄ。ＧＣＨＶ能在稀有鲫体内传代,并诱导８０％以上的稀行鲫患病死亡。将人工感染ＧＣＨＶ的稀有鲫病鱼组织超薄切片,电镜观察,发现在肠道、脾脏、肾脏等组织中存在大小与形态和ＧＣＨＶ相似的病毒颗粒。从稀有鲫出血病病鱼组织中纯化病毒,免疫电镜观察,发现病毒颗粒能被ＧＣＨＶ的特异性抗体聚集成团。由上可知,稀有鲫出血病是由ＧＣＨＶ感染所致,稀有鲫对ＧＣＨＶ是敏感的,可以作为草鱼抗出血病育种的模型。     

小发夹RNA在稀有鮈鲫胚胎中的表达

由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面。多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种,操纵一段短发夹结构RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在细胞或体内表达。这一类启动子主要包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等。为了探明鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子是否能有效驱动shRNA在鱼体内表达,从而更好地利用RNAi进行鱼类基因功能和抗病毒研究,研究利用斑马鱼的H1和U6启动子以及草鱼的H1启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,分别构建了三个shRNA表达载体:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP。通过显微注射将三种表达载体分别导入稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)受精卵中。由于siRNA片段很短,其表达检测非常困难,研究采用stem-loop RT-PCR方法,对稀有鮈鲫胚胎发育不同时期的shRNA表达进行了检测。研究结果表明,采用的三种鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子均能有效驱动GCRVsiRNA的表达;在取样的各个胚胎发育时期均能检测到GCRV siRNA的表达;stem-loop RT-PCR方法可以便捷检测siRNA的表达。研究构建的鱼类胚胎siRNA有效持续表达载体,建立的简易快捷siRNA检测方法,为进一步的抗GCRV转基因鱼研制以及siRNA的病毒复制干扰机制研究奠定了重要基础并提供有力的技术支撑。     

稀有Ju鲫对草鱼出血病病毒敏感性的初步研究

本文报道稀有Ｊｕ鲫对草鱼出血病病毒的敏感性。ＧＣＨＶ是草鱼出血病的病原,用ＧＣＨＶ人工感染１－６月龄的稀有Ｊｕ鲫,在水温２２－３２℃时能导致稀有Ｊｕ鲫出现出血病症状。在水温２８℃时,病鱼在１ｄ内死亡,潜伏期为５ｄ,发病高峰期在感染后第６－８ｄ。ＧＣＨＶ能在稀有Ｊｕ鲫体内传代,并诱导８０％以上的稀有Ｊｕ鲫患病死亡。将人工感染ＧＣＨＶ的稀有Ｊｕ鲫病鱼组织超薄切片,电镜观察,发现在肠道,脾脏,肾脏等组织     

草鱼出血病病毒人工感染稀有鼩鲫出血病鱼的组织病理观察

草鱼出血病病毒人工感染稀有鲫出血病病鱼组织病理切片观察,发现肌肉系统血外渗,出现微血栓,红血球浸润于肌纤维之间;鳃小片上皮细胞增生和肥大导致相互融合,血外渗和红血球裂解,形成微血栓和血泡;肠上皮细胞脱落,红血球散布于整个肠壁;肝细胞肥大和细胞实质空泡化,细胞间隙增大;脾组织黄褐色的“小结”增多。而对照鱼未出现上述变化,说明这些病理变化确由ＧＣＨＶ感染所致。     

草鱼出血病病毒人工感染稀有Ju鲫出血病鱼主要器官组织的超薄…

用电子显微镜观察了稀有Ｊｕ鲫出血病鱼的病理切片及对照鱼的超薄切片。在对照鱼的鳃、肠道、肾脏、肌肉和肝脏中没有见到任何病毒颗粒。在病鱼鳃血管内皮细胞质中观察到聚集的直径７０ｎｍ左右的ＧＣＨＶ颗粒,说明鳃是ＧＣＨＶ侵袭的主要器官之一,并讨论了鳃对ＧＣＨＶ敏感在ＧＣＨＶ传播的意义。还在病鱼肠道,肾脏中观察到成片的病毒颗粒,它们也是ＧＣＨＶ侵袭的主要组织。在病鱼脾脏在电子密度低在细胞质中观察到散在的病毒可     

草鱼出血病病毒人工感染稀有(鱼句)鲫出血病鱼主要器官组织的超薄切片观察

用电子显微镜观察了稀有(鱼句)鲫出血病(Hemorrhage of Gobiocypris rarus)鱼的病理切片及对照鱼的超薄切片。在对照鱼的鳃、肠道、肾脏、脾脏、肌肉和肝脏中没有见到任何病毒颗粒。在病鱼鳃血管内皮细胞质中观察到聚集的直径70nm左右的GCHV颗粒,说明鳃是GCHV侵袭的主要器官之一,并讨论了鳃对GCHV敏感在GCHV传播中的意义。还在病鱼肠道,肾脏中观察到成片的病毒颗粒,它们也是GCHV侵袭的主要组织。在病鱼脾脏的电子密度低的细胞质中观察到散在的病毒颗粒。很少见到病毒聚集体,脾脏中的病毒可能是脾脏的吞噬细胞吞噬而来。作者认为在病鱼组织中观察到的大小不同的病毒颗粒是处于不同成熟阶段的GCHV。     

温度对草鱼出血病影响的初步探讨

将鱼呼肠孤病毒(FRV)感染的草鱼饲养在人工控温的水族箱内,水温在24—30℃恒温时其死亡率无显著差异(P>0.05),而在20℃和33℃恒温时死亡率则明显降低,与24℃—30℃恒温相比死亡率有非常显著差异(P<0.01)。人工感染恒温饲养期间,死亡高峰期随水温降低而推迟,缓慢改变水温能降低死亡率,在低于20℃攻毒并维持一星期左右,即使逐步升温至30℃也不会导致感染鱼的大批死亡。     

草鱼出血病病毒多肽的免疫原性

采用中和试验比较了草鱼出血病病毒ＧＣＨＶ８７３的１１个多肽的免疫原性,确定了主要中和抗原。纯化的单个病毒多肽免疫家兔获得抗血清,多太ＶＰ１、ＶＰ５、ＶＰ６和ＶＰ９的抗血清具有中和效价,而ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ８、ＶＰ１０和ＶＰ１１则不能诱生中和抗体。其中ＶＰ５的抗血清中和效价最高,因此,ＶＰ６极可能是病毒多肽中的主要中和抗原。     

草鱼出血病病毒对其它鱼的感染性研究

用草鱼出血病病鱼分离出的草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus,GCHV)感染其它常见鱼并用ELISA方法检查感染鱼组织提取液,结果表明:青鱼、鲢鱼、布氏鳌条对GCHV抗体呈阳性反应;鲤鱼、鳙鱼、鲫鱼、团头鲂、泥鳅则呈阴性反应。综合感染鱼发病症状及死亡特征,初步认为:青鱼对GCHV是易感的,GCHV能在鲢鱼、布氏蟹条体内增值,但毒力较低,鳙鱼、鲫鱼、团头鲂、鲤鱼、泥鳅能抗GCHV感染。     

几种鱼类细胞对草鱼呼肠孤病毒敏感性的研究

比较研究了鲫鱼异倍体细胞系(CAB-80)、团头鲂尾鳍细胞系(BCC)、大鳞副泥鳅雌核发育单倍体胚胎细胞系(PHG)、草鱼胚胎细胞系(GCE)、草鱼尾鳍细胞系(GCRF-2)、草鱼肾细胞系(GCK-84)及其四个克隆对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的敏感性。证实了这些细胞(PHG除外)在不同程度上对GCRV敏感,其中以GCK-84的敏感性最强。这表明,在体外培养条件下,GCRV并无严格的种族特异性。用经GCK-84传代的病毒感染草鱼种,能复制出典型的出血病症状。用GCK-84检测了病毒在GCK-84、GCRF-2、CAB-80、BCC和PHG中的滴度(TCID_(50/ml)),其值分别为8.24,7.36,2.90,2.15和1.33。4个克隆与肾细胞系对病毒的敏感程度亦不尽相同,其滴度在6.3到9.32之间变化。上述结果对细胞工程抗病育种预示有较大的潜在意义。在电镜下可见GCRV对被感染的细胞造成了严重的破坏。病毒为平均直径58nm的球形颗粒,具有一个高度电子密度的核心,平均直径约为38nm。病毒在细胞中的分布方式有三种:即散布于细胞质中的、呈晶格状包于一膜状结构中的和整齐或不整齐地聚集在一起但无膜包裹的。     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因功能区在原核细胞中的表达

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus)为我国分离、鉴定的第一株水生动物病毒.1983年,我国首次报道引起爆发性草鱼出血病的病原为草鱼出血病病毒[1,2],其后相继进行了系统的病毒形态学、生物学、生物化学及分子生物学特性等研究[3-8].自1979年Meyers T R等报道从水生动物中分离出第一株呼肠孤样病毒,迄今国际上已分离鉴定40余种水生呼肠孤病毒(aquareovirus).在这些分离株中,大多数毒株不能引起寄主的病理反应或仅表现出较弱的致病性.然而研究认为,GCRV为水生呼肠孤病毒中致病力最强的毒株[9].可见,以GCRV为模型,研究水生呼肠孤病毒的复制与致病机理具有一定的理论及实际意义.我们在对GCRV反应核心及体外转录研究中,已证实GCRV RNA聚合酶在病毒粒子中的存在及其位置[5];GCRV序列测定及定位结果显示,GCRV-VP2多肽为该病毒RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase RdRp)[6,7].为了探讨草鱼呼肠孤病毒的侵染与宿主的相关性及复制机制,我们首次进行了该病毒RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)功能区序列在原核细胞中的表达研究,并得到高效表达融合蛋白.这一结果将为该酶的活性及特性分析提供实验依据.下面报道本研究结果.     

草鱼呼肠孤病毒（GCRV）部分基因片段cDNA文库的构建

在随机六聚体引物浓度不变条件下 ,分别采用 0 .5、2、5μg草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)单一片段RNA进行反转录cDNA合成及文库构建。结果表明 ,在GCRV RNA模板浓度大于 2 μg时 ,第二链cDNA合成产物可直接通过EB染色的琼脂糖凝胶电泳进行定量及鉴定。选择cDNA与载体连接比率为 5∶1,在高效电转化条件下 ,可获得 10 6 转化子 /μgcDNA的转化效率。阳性克隆子经酶切及PCR鉴定 ,约 4 5%以上的插入片段大于 50 0bp。     

3D reconstruction and capsid protein characterization of grass carp reovirus

Grass carp reovirus (GCRV) is a relatively new virus first isolated in China and is a member of the Aquareovirus genus of the Reoviridae family. Recent report of genomic sequencing showed that GCRV shared high degree of homology with mammalian reovirus (MRV). As a step of our effort to understand the structural basis of GCRV pathogenesis, we determined the three-dimensional (3D) structure of GCRV capsid at 17 Å resolution by electron cryomicroscopy. Each GCRV capsid has a multilayered organization, consisting of an RNAcore, an inner, middle and outer protein layer. The outer layer is made up of 200 trimers that are arranged on an incomplete T=13 icosahedral lattice. A characteristic feature of this layer is the depression resulting from the absence of trimers around the peripentonal positions, revealing the underlying trimers on the middle layer. There are 120 subunits in the inner layer arranged with T=1 symmetry. These structural features are common to other members of the Reoviridae. Moreover, SDS-PAGE analysis showed that GCRV virions contain seven structural proteins (VP1-VP7). These structural proteins have a high degree of sequence homology to MRV, consistent with the structural similarities observed in our study. The high structural similarities of isolated GCRV and MRV suggest that future structural studies focusing on GCRV entering into and replicating within its host cell are necessary in order to fully understand the structural basis of GCRV pathogenesis.     

两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较

水生呼肠孤病毒为感染水生动物的一类病原体,隶属于呼肠孤病毒科新建水生呼肠孤病毒属.草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是引起中国南方淡水养殖草鱼暴发性出血病病原,鮁鱼呼肠孤病毒(Threadfin reovirus,TFV)是引起海水养殖鮁鱼病毒病病原.本研究将GCRV与新加坡TFV分离株进行了部分特性比较研究.结果表明,GCRV与TFV均能感染CIK细胞,但对其它鱼类细胞系的敏感性有所差异.此外,凝胶电泳与逆转录聚合酶链式扩增显示,GCRV与TFV核酸属不同的基因型.在多肽特性上,证实了GCRV的5条主要结构多肽具有与FTV及水生呼肠孤病毒相似的特性.Western blot 检测显示,草鱼呼肠孤病毒与TFV结构蛋白拥有部分相同的抗原决定簇.