高通量测序技术在细菌耐药中的应用

细菌耐药已成为威胁全球人类公共健康的重要因素之一,快速、准确明确细菌耐药的特性、机制及传播特征对疾病治疗及控制耐药菌的传播具有重要意义。高通量测序技术可以同时平行检测多个基因序列的状态,已广泛应用于细菌耐药检测。目前高通量测序技术在细菌耐药领域的应用主要有：全基因组测序技术、目标区域测序技术和宏基因组测序技术。所采用的测序平台主要为Illumina、Ion Torrent、BGI等二代测序和Pacific Biosciences、Oxford Nonopore等三代测序平台。通过细菌耐药基因预测细菌耐药表型的准确性在很大程度上依赖于成熟的专业耐药基因数据库,各种通用型、特异型及隐马尔可夫模型耐药基因数据库的建立和完善,为高通量测序技术在细菌耐药领域的应用提供了坚实的基础。本文简要介绍了高通量测序技术、数据分析方法及相应测序平台在细菌耐药领域中的应用进展,并同时介绍了细菌耐药数据库的现状。     

高通量测序技术在食品微生物研究中的应用

高通量测序技术的快速发展对食品微生物发酵过程和机制研究产生了深刻的影响,主要体现在食品微生物生理功能、代谢能力和进化的研究以及食品微生物群落结构、动态变化及其对环境的响应机制等方面。另外,通过对食品微生物基因组和元基因组进行数据分析,也对食品发酵过程优化、微生物功能改造、食源性微生物疾病预防和控制等提供了重要的依据。本文总结了近年来利用高通量测序技术对食品微生物基因组和元基因组进行测序的研究,并探讨了测序技术的发展对食品微生物研究的影响及发展趋势。     

高通量测序分析云南腾冲热海热泉微生物多样性

【背景】云南腾冲热海热泉中蕴含着丰富的极端微生物资源。【目的】揭示云南腾冲热海热泉中微生物物种多样性及群落结构差异,发掘酸性热泉中铁、硫氧化功能微生物。【方法】采用Illumina HiSeq高通量测序技术对3处热泉15个水体样品中微生物16SrRNA基因V4-V5区进行测序及生物信息学分析。【结果】3处热泉中共获得578061条有效序列,聚类为141个可操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU),包括19个门66个属。鼓鸣泉(GMQ)、蛤蟆嘴(HMZ)、黄瓜箐(HGQ)3处热泉均以泉古菌门(Crenarchaeota)和厚壁菌门(Firmicute)为主。从属水平分析,碱性热泉鼓鸣泉(GMQ)和中性热泉蛤蟆嘴(HMZ)分别注释到37、32个属,优势属均为芽孢杆菌属(Bacillus)和热棒菌属(Pyrobaculum)。酸性热泉黄瓜箐(HGQ)共注释到20个属,优势属为酸杆菌属(Acidibacillus)和酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus),此外,具有铁、硫氧化潜力的菌属有喜酸菌属(Acidicaldus)、硫化芽孢杆菌属(Sulfobacillus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)及生金球菌属(Metallosphaera)等,进一步通过硫氧化培养基分离获得了这些菌属中的纯菌株。【结论】云南腾冲热海热泉水体中蕴含丰富的微生物资源,热泉间微生物物种组成差异明显;酸性热泉中存在多种具有潜在铁、硫代谢功能的菌种;未分类类群、非培养类群丰度很高,尤其是蕴藏着可观的古菌资源。     

基于高通量测序的枇杷花药微生物多样性研究

果树具有较高的经济价值,并大多依赖传粉者实现繁殖成功以保证产量。花药微生物能影响植物的花粉活力,其组成也可能受到传粉者访问的影响;理解花药微生物的多样性和群落构建模式对于提高果树的繁殖适合度具有潜在意义,但目前相关研究仍相对缺乏。本研究基于高通量测序技术分析了传粉者访问前（套袋组）与访问后（访问组）枇杷（Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.）花药中真菌与细菌的组成及差异。结果显示,传粉者访问未显著改变花药微生物的多样性及组成,套袋组中优势真菌科为枝孢菌科与球腔菌科,访问组优势真菌科则为枝孢菌科与梅奇酵母科。此外,两组中优势细菌科均为产碱杆菌科与欧文菌科。研究结果表明,枇杷花药微生物具有相对稳定的群落结构,传粉者不是驱动花药微生物群落构建的主要因素。     

基于高通量测序技术的微生物检测数据分析方法

高通量测序技术的发展正在逐渐改变诸多生物学领域的研究方法.为应对突发疫情以及新发未知微生物威胁的需求,微生物鉴定技术逐渐从传统的物理化学方法及核酸杂交等分子水平方法进一步走向利用无需培养的测序数据进行快速分析检测.随之而来的是对高通量数据分析在精度及速度的要求.基于高通量测序数据的微生物检测数据分析方法在近些年得到了快速的发展.本文分析了目前基于高通量测序数据的微生物检测数据分析方法,对其数据分析的处理流程和计算方法进行了研究,比较了各个微生物检测数据分析方法的特点及适用场景.最后结合本实验室工作总结微生物检测数据分析方法在实际应用中可能遇到的问题,希望对该应用领域的研究有一定的参考意义.     

基于高通量测序研究青藏高原茶卡盐湖微生物多样性

【目的】茶卡盐湖(Chaka Salt Lake,CSL)是青藏高原有名的天然结晶盐湖,具有独特的石盐盐湖矿床,盛产青盐。盐湖卤水环境中存在丰富的嗜盐菌资源和潜在的新种,细菌和古菌的群落结构特征和物种多样性尚不明确。【方法】采用Illumina高通量测序平台对茶卡盐湖水样和底泥混合物中的细菌和古菌群落进行16S r RNA基因(V3-V5区)高通量测序,检测4个样本的群落结构差异和微生物多样性。【结果】获得细菌和古菌总有效序列分别为117 192和110 571条。结果分析表明细菌和古菌的物种注释(Operational taxonomic unit,OTU)数目分别为421和317,获得分类地位明确的细菌种类为14门28纲170属,古菌为5门4纲34属。细菌的优势类群是厚壁菌门(Firmicutes),所占比例为68.37%,其次为变形菌门Proteobacteria(20.49%);优势种属依次为芽孢杆菌属Bacillus(41.94%)、海洋芽孢杆菌属Oceanobacillus(8.03%)、假单胞菌属Pseudomonas(7.67%)、盐厌氧菌属Halanaerobium(7.42%)和乳球菌属Lactococcus(7.38%);古菌的优势类群以广古菌门(Euryarchaeota)盐杆菌纲(Halobacteria)为主,优势菌是Halonotius(17.21%)和盐红菌属Halorubrum(16.23%)。【结论】揭示了茶卡盐湖中细菌和古菌的群落结构及物种多样性,为嗜盐菌的开发及后续微生物资源的挖掘提供了理论依据。     

生物芯片技术及其在病原微生物检测方面的进展

生物芯片 ( biochip)是二十世纪 90年代中期发展起来的一项尖端技术 [1 ] 。它以玻片、硅为载体 ,在单位面积上高密度地排列大量的生物材料 ,从而达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的。基因芯片、蛋白芯片等都属于生物芯片的范畴。生物芯片根据芯片上的探针不同 ,可分为蛋白芯片和基因芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白 ,则称为肽芯片或蛋白芯片。如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或靶 DNA,则称为基因芯片。生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。生物芯片能为现代医学科学及医学诊断…     

基于高通量测序的禁牧对土壤微生物群落结构的影响

麋鹿的采食、躺卧和践踏行为均会对栖息地土壤环境造成影响,进而影响土壤微生物群落结构。利用高通量测序技术,分析江苏大丰麋鹿国家级自然保护区禁牧点和补饲点土壤细菌和真菌群落结构差异,并结合土壤理化性质探究禁牧对土壤微生物群落结构的影响。结果表明细菌群落的优势菌门为变形菌门,真菌群落的优势菌门为子囊菌门。禁牧改变了土壤微生物群落结构,在门水平上提高了变形菌门、放线菌门和担子菌门的相对丰度,降低了绿弯菌门、厚壁菌门和子囊菌门的相对丰度,禁牧点与补饲点土壤微生物群落多样性的相似性较低。冗余分析中,细菌受土壤环境因子的影响大于真菌,其中土壤pH是影响细菌和真菌群落最大的土壤环境因子。研究揭示了禁牧对土壤微生物群落结构的影响,为保护区制定麋鹿生境恢复方案提供参考。     

古代病原微生物基因组的研究进展

古代病原微生物基因组研究对病理学、微生物学、考古学等领域均具有重要的价值。在过去的十年里,高通量测序和靶向富集技术的发展和应用使古代微生物基因组的获取成为可能,通过对古代人群样本中获取的宏基因组进行筛查,使得引发古代疫情的相关病原体的基因组得以重建,为研究人类传染病的起源、传播和演化提供了一个独特的窗口。在当今全球化的背景下,新发及再发传染性疾病的出现频率促使我们回顾过去,以便更好地了解现代病原菌出现和古代病原菌重新出现的过程和生态环境。在这篇文章中,我们总结了近十年古代病原微生物基因组水平的研究进展,并提出了这项研究所面临的挑战以及未来的研究前景和方向。     

高通量测序技术分析猪粪堆肥过程中微生物群落结构变化

为了解猪粪堆肥过程中微生物群落结构组成及多样性的变化,采集猪粪堆肥过程的三个代表性样品—新鲜猪粪、高温堆肥、腐熟堆肥,利用Illumina Miseq高通量测序技术对16S rRNA V4～V5可变区序列进行测序,分别获得37 009、42 470、36 713条有效序列及328、280、160个操作分类单元(OTU)。Alpha多样性分析表明,在堆肥过程中微生物群落丰富度呈现降低趋势,而多样性呈现先上升后下降趋势。随着堆肥的进行,在门水平上,厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门相对丰度降低,而变形菌门和放线菌门相对丰度升高;在属水平上,Turicibacter、Terrisporobacter、Parabacteroides、Clostridium sensu stricto、Corynebacterium等来自动物肠道的微生物相对丰度明显下降,Thermopolyspora、Thermomonospora、Thermobifida、Halocella等耐热耐盐微生物成为最主要优势菌。堆肥过程不同菌群优势度的变化是微生物与堆肥中各理化因子相互作用的结果。     

基于转录组测序分析人大细胞肺癌NCI-H460细胞对类泛素化抑制剂MLN4924的潜在耐药机制

目的探讨人大细胞肺癌NCI-H460细胞对类泛素化抑制剂MLN4924潜在新型耐药机制。 方法利用MLN4924处理NCI-H460细胞,筛选和建立耐药细胞株。对普通NCI-H460对照细胞、MLN4924处理8 h加药细胞株、48 h加药细胞株和建立成功的耐药株进行高通量转录组测序。根据测序结果筛选差异表达基因,并进行通路富集分析。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett-t检验。 结果共构建3个NCI-H460耐药细胞株。转录组测序分析显示,与对照比较,MLN4924处理8 h加药株、处理48 h加药株、三株耐药株分别筛选出5 303、4 186、3 388、3 675和3 267个差异表达基因,包括ABCA9、ABCA13、CYR61和CYP39A1等基因。RT-qRCR实验进一步验证了在瞬时加药组和耐药株中ABCA9和CYR61基因高表达。GO富集分析结果显示,差异表达基因与细胞周期、细胞凋亡、细胞间信号转导和细胞黏附等细胞生物过程高度相关,还与细胞核和细胞膜等细胞组分密切相关。KEGG通路富集分析结果显示,耐药细胞中差异表达基因集中在MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路和cAMP信号通路等。 结论在人大细胞肺癌NCI-H460细胞中,ABCA9、CYR61、ABCC8和CYP4F12等基因的表达变化可能会提高其对MLN4924的耐药能力。这种耐药能力可能与MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路和cAMP信号通路有关。     

基于Illumina MiSeq高通量测序技术分析硇洲岛海星共附生微生物多样性

【背景】海星作为海洋生物中的一类比较高级的棘皮类动物,其体内蕴藏着丰富且具有生物活性的共附生微生物资源。【目的】分析湛江硇洲岛海星中共附生微生物的多样性。【方法】采用IlluminaMiSeq高通量测序技术分别对硇洲岛海星进行共附生细菌16SrRNA基因V3-V4区和共附生真菌18S rRNA基因ITS1-ITS2区的测序,并根据测序结果进行OTU聚类分析、α多样性分析及物种分类分析等。【结果】高通量测序获得细菌和真菌Filtered的数目分别为61992和71196个,OTU数目分别为2384和529个。经物种分类分析,共附生细菌主要为变形菌门(Proteobacteria),其平均相对含量高达77.37%;其次是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria);其中优势细菌属为嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和乳球菌属(Lactococcus)。共附生真菌主要为子囊菌门(Ascomycota),其相对含量高达92.33%;其次是霉菌门(Fungi)、担子菌门(Basidi...     

基于宏基因组学分析安徽地区畜禽粪便微生物耐药性特征

目的为深入了解在食用动物生产过程中滥用抗生素,迫使肠道共生细菌成为微生物耐药性（antimicrobial resistance,AMR）重要宿主之一的现象,本研究利用宏基因组学针对食用动物的肠道细菌AMR进行分析。方法利用宏基因组学技术对安徽地区猪和鸡粪便中的AMR及可移动遗传元件进行定量和表征,并且在核心抗性基因亚型水平上研究猪和鸡共生细菌群落的耐药性特征。结果从抗性基因（antimicrobial resistance gene,ARG）的丰度和多样性来看,鸡肠道共生菌中ARG的多样性和检出率高于猪,而猪肠道共生菌中ARG总丰度高于鸡。大环内酯―林可酰胺―链菌素类抗性基因和四环素抗性基因是所有样本中含量最高的2种ARG,研究也检测到了世界范围内流行的ARG,包括optrA、qnrS、lsaE和tem等,同时,一些可移动遗传元件,包括噬菌体、质粒和插入序列也显示出与ARG存在一定相关性,这揭示了ARG的水平转移潜力。此外,食物链动物的抗性组和微生物组之间在统计学上也被证明存在正相关性。宿主溯源分析表明,在鸡样本中的拟杆菌和大肠埃希菌被检测出含有大量ARG,而在猪的样本中被检测出含有丰富ARG的为瘤胃球菌和罗氏菌。结论本研究通过对猪和鸡共生细菌群落中AMR的调查统计,证实肠道微生物群是ARG的重要宿主及传播途径之一,为评价食用动物安全性及后续泛耐药基因数据库的构建提供科学依据,对公共健康具有重要意义。     

肠道气泡堆积对银鲳肠道菌群结构的影响

为研究肠道气泡堆积对银鲳(Pampus argenteus)肠道菌群的影响,2019年3月于东海水产研究所福鼎研究中心采集了15尾肠道气泡堆积的银鲳为病鱼组,15尾健康银鲳为健康鱼组,并通过16S r DNA基因DNA高通量测序技术结合LEfSe分析方法,对两组样品间菌群结构和多样性进行对比分析。结果显示,病鱼组肠道菌群多样性与健康鱼组无显著差异(P> 0.05),但病鱼组肠道菌群的均匀度和相对丰度都显著低于健康鱼组(P <0.05)。两组样品的优势菌群均为变形菌门(Proteobacteria),且相对丰度都较大(超过97%)。此外,利用LEfSe分析两组样品发现,病鱼组中如根瘤菌(Rhizobium)、栖热菌(Thermus)等好氧菌丰度显著高于健康鱼组,而不动肝菌(Acinetobacter)、微酸菌(Ilumatobacter)等显著低于健康鱼组,蓝细菌(Cyanobacteria)相对丰度显著高于健康鱼组。由此可以表明,肠道气泡堆积很可能会引发肠道菌群紊乱。     

我国重要病原性真菌的耐药性研究现状

近年来,病原性真菌的耐药现象越来越多,呈逐年上升趋势,且所致侵袭性感染已成为目前临床上患者死亡的重要原因之一。本文就我国在耐药性真菌的判断、流行病学、耐药机制及其防治等方面的研究现状进行简单介绍。     

支气管扩张急性加重期病原学分布及耐药性分析

【摘 要】 目的 分析不同病程支气管扩张急性加重期患者的病原及耐药情况,为临床合理用药提供参考。方法 选择2010年1月至2012年12月入住东南大学附属中大医院呼吸内科经HRCT确诊的支气管扩张的138例患者,根据入院时病史记录的病程时间,将患者分成病程＜10年（组Ⅰ）33例,10～20年组（组Ⅱ）52例及＞20年组（组Ⅲ）53例,分析不同组间病原学构成及耐药性。结果 共104例患者送检痰培养,其中有效痰标本256份,阳性标本108份（痰菌阳性率42.2%）。共分离出病原菌121株,其中,革兰阴性菌88株,革兰阳性菌17株,真菌16株。阴性菌中以铜绿假单胞菌最多（55.7%）。三组患者的痰真菌阳性率分别为7.7%、6.1%和23.9%,组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在痰培养结果为阴性杆菌中,耐药情况比较普遍,其中,铜绿假单胞菌的耐药率随着病程的延长有所增加,在＞20年组患者,对亚胺培南及美罗培南的耐药率分别达到34.4%和37.5%,与其他两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 不同病程的支气管扩张患者,革兰阴性杆菌特别是铜绿假单孢菌仍是急性加重的主要因素,大于20年病程的患者对亚胺培南及美罗培南的耐药率增高,合并真菌感染的比例增加。     

临床常用抗生素对G-致病菌的效价分析

目的:调查我院常用抗生素的种类及其对,临床常见的G~-致病菌的效价情况,为合理选用抗生素提供临床资料。方法:从2246个样本中分离到646株G~-致病茵,用全自动微生物分析仪-VITEK 32进行菌种鉴定及20种抗生素的药敏实验。结果:646株G~-致病菌经鉴定属于14大类,其中铜绿假单胞菌160株,占24.77%;大肠埃希氏菌135株,占20.90%;鲍曼不动杆菌90株,占13.93%;克雷伯菌属116株,占17.96%;其它9种G~-致病菌所占的比例均小于7%。头孢类抗生素是目前最为常用的。在检测的20种抗生素对检测的14种G~-致病菌的效价最高的前三位分别是:亚胺培南(IMP)82.66%、美洛西林(MEZ)81.15%、环丙沙星(CIP)61.06%;效价最差的三位分别是:头孢呋辛(CFO)23.76%、头孢噻吩(CEP)26.74%、替卡西林(TIC)31.58%。结论:经典的抗生素对G~-致病菌的效价不容乐观,且非科学的联合用药可能会降低药效。     

头孢类抗生素对6种G-致病菌的效价分析

目的:调查头孢类抗生素对G-致病菌的效价情况,为头孢类抗生素的合理使用提供临床资料.方法:从我院三代常用头孢类抗生素中随机选取7种共21种抗生素,采用平板培养纸片扩散K-B法检测对我院常见的G致病菌(铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌)的效价情况.结果采用阳性( )、阴性( )、可变( \-)表示.结果:第一代头孢类抗生素的效价最低,第二代头孢类抗生素的效价整体居中,第三代头孢类抗生素的效价整体最好,但也有少数种类的效价低于第二代.结论:三代抗生素的对这六种常见致病菌的效价与代数成正比,但第三代头孢类抗生素的效价仍不够乐观.     

临床标本优势菌种分布及耐药分析

目的了解临床标本中微生物分离率及其耐药性,为微生物检验教学改革提供临床依据。方法对近一年来临床标本的细菌分离情况及耐药性进行回顾性统计和分析,使用SPSS 13.0软件,采用计数资料进行统计描述分析。结果从2 989份标本中分离出644株病原菌,其中G-杆菌占67.7%,G+球菌占23.29%,真菌58株占9.01%。药敏结果显示大多细菌呈现泛耐药性。结论临床感染以G-杆菌为主,G-杆菌又以NFGNB常见,而G+球菌中肠球菌占主要地位。且这些细菌对常用抗菌药物耐药严重。     

抗生素对临床常见G+致病菌的效价分析

目的:调查我院常用抗G~ 致病菌的抗生素的种类效价情况,为抗G~ 致病菌的合理用药提供依据。方法:从2978个样本中分离到953株G~ 致病菌,用全自动微生物分析仪-VITEK32进行菌种鉴定及16种抗生素的药敏实验。结果:953株G~ 致病菌经鉴定属于11大类,其中金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、草绿色链球菌和肠球菌属是五类主要的G~ 致病菌,依次分别占总分离量的30.3%、17.3%、15.1%、9.8%和6.8%;在检测的16种抗生素对排在前五位的G~ 致病菌的平均效价最低的五类抗生素是:青霉素(24.22%)、红霉素(26.22%)、头孢唑林(28.06%)、与链霉素(30.52%)和庆大霉素(31.06%)。而抗G~ 致病菌整体效果最好的是:螯合新泰林(93.72%)、万古霉素(82.62%)和四环素(78.68%)。结论:研究结果表明越来越多抗生素抗临床常见G~ 致病菌的效价呈现逐年递减的趋势。