解淀粉芽孢杆菌抗菌机制研究进展

自然界中,细菌与细菌之间、细菌与其他生物之间存在广泛的相互作用。细菌产生的代谢物质可以提高自身在自然界中的竞争/生存能力。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）能够产生种类繁多的抑菌物质,有效地抑制真菌和其他细菌的活性,是一类应用较广的生防菌。到目前为止,解淀粉芽孢杆菌的抑菌作用研究已经广泛开展,但是生物体是复杂多变的,仍然有很多东西是未知的,并且利用解淀粉芽孢杆菌进行生物防治的前景十分广阔,所以加强对抑菌物质的机制研究、提取相关抗菌物质尤为关键。本文综述了国内外有关解淀粉芽孢杆菌的抑菌机制研究,为进一步探究解淀粉芽孢杆菌的抑菌机制、抑菌基因和基因工程菌做好铺垫。     

解淀粉芽孢杆菌研究进展

解淀粉芽孢杆菌具有广泛的抗菌能力,在环保、种植业、水产养殖业具有广泛的应用前景。本文对近年来关于解淀粉芽孢杆菌的研究与探索,从分离、筛选、鉴定、优化培养、分子生物学鉴别、代谢产物分析及应用研究方面进行了总结。     

解淀粉芽孢杆菌在畜牧业中的应用进展

解淀粉芽孢杆菌是一种广泛应用于养殖业的益生菌。该菌可通过降低畜舍内氨气等有害气体的含量、减少畜禽粪便中钙及磷等物质的排出量并降低畜舍空气中大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌等有害微生物的数量等方式来改善畜舍环境。同时解淀粉芽孢杆菌能促进细胞免疫因子的分泌,提高动物的免疫力,缓解畜禽的免疫应激。此外,该菌还能分解难以降解的纤维素,中和抗营养因子,促进饲料在肠道内的消化,提高饲料转化率。本文就解淀粉芽孢杆菌在上述几方面的作用进行阐述,以期为该菌在动物生产中的应用提供理论依据。     

解淀粉芽孢杆菌分子遗传操作及其应用研究进展

解淀粉芽孢杆菌是FDA认定的安全级(generally recognized as safe,GRAS)菌株,在工业酶制剂、高分子聚合物、大宗化学品、绿色生物农药等方面的生产具有突出的优势.近年来,随着解淀粉芽孢杆菌的分子遗传操作技术越来越成熟,对利用该菌开发成微生物发酵平台化菌株用于合成生物学制造领域提出了更迫切的需...     

利用人工Mu转座技术研究解淀粉芽孢杆菌的功能基因

目的:利用人工Mu转座技术研究解淀粉芽孢杆菌的功能基因。方法:使用加入0.5%甘氨酸的M9-YE培养基,细菌生长到D600nm值为0.5时制备感受态细胞,加入Mu转座复合物(含42ngMuDNA),以1.8kV电压电击获得转化子。对转化子进行功能突变表型筛选、基因克隆、DNA序列分析,以确定插入突变的功能基因。结果:获得最佳电转化效率1.9×103CFU/μgDNA。同时获得2个芽孢杆菌抑真菌作用的调节基因rpmGA和yxlC。结论:人工Mu转座技术是研究芽孢杆菌功能基因的快速有效的好方法。     

解淀粉芽孢杆菌BamHI甲基转移酶基因克隆、功能鉴定与序列分析

从解淀粉芽孢杆菌Baillus amyloliquefaciens CICIM B2125中克隆了BamHI甲基转移酶基因(bamHIM),并在大肠杆菌JM109中得到了成功表达.该基因含有1 271 bp的开放阅读框(ORF),编码423个氨基酸,成熟蛋白分子量为49 kD.该基因在自身启动子引导下,表达了具有活性的BamHI甲基转移酶(M.BamHI).该酶可以将BamHI位点的碱基甲基化.氨基酸序列分析表明该酶存在有NADB_Rossmann结构域.     

解淀粉芽孢杆菌高效合成胞苷的代谢调控机制及育种策略

胞苷是合成抗病毒、抗肿瘤药物的良好中间体,也是核苷酸类保健食品和功能性食品的重要原料。主要论述了解淀粉芽孢杆菌高效合成胞苷的代谢调控机制和构建胞苷高产菌株的育种策略。重点阐述了通过提高解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子转录水平,增强胞苷合成代谢途径、阻断胞苷降解途径、增大磷酸戊糖途径向胞苷合成途径的分流量、提高胞苷合成前端代谢物PRPP的合成量、增强中心碳代谢流向胞苷合成途径、减少旁路代谢途径及促进胞苷的分泌等方法,选育出胞苷高产菌株,不仅为胞苷高产菌株的选育提供参考,也为解决目前胞苷工业化生产中存在的问题提供思路。     

响应面法优化解淀粉芽孢杆菌C101发酵培养基

采用响应面法对解淀粉芽孢杆菌C101菌株产芽孢发酵培养基进行了优化。利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响产孢的3个主要因素:MnSO4、KH2PO4和(NH4)2SO4。在此基础上运用最陡爬坡路径法逼近最大响应值区域,最后利用响应面分析法确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明,蔗糖20 g/L,尿素4.0 g/L,豆粕4.0 g/L,KNO3 2.0 g/L,Na2HPO4 2.4 g/L,KH2PO4 0.52 g/L,(NH4)2SO4 0.55 g/L,NaCl 1.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.50 g/L,FeSO4 0.005 0 g/L,MnSO4 0.005 4 g/L,C101最大理论芽孢含量为14.67×108个/mL。经3次平行试验验证,实际平均芽孢含量与预测芽孢含量相近,比之前的芽孢含量提高了188%。     

蛋白酶对解淀粉芽孢杆菌α—淀粉酶活力的影响

目前工业生产α－淀粉酶的主要菌种是解淀粉芽孢杆菌,该菌在培养条件下不但产生α－淀粉酶,同时也产生一定比例的蛋白酶。本文研究了不同来源的蛋白酶对解淀粉芽孢杆菌ＢＦ７６５８和８６３１５α－淀粉酶活性的影响。结果表明发现中性蛋白酶对两种α－淀粉酶活性无显著影响,而２７０９碱性蛋白酶能使α－淀粉酶活性丧失６０％以上。     

普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达

根据文献报道的核苷酸序列合成Bacillus deramificans普鲁兰酶成熟肽编码基因BdP。将BdP基因插入芽孢杆菌分泌表达载体pUC980信号肽编码区下游,获得重组质粒pUC980-BdP,重组质粒转化中温α-淀粉酶生产菌解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株。摇瓶发酵实验表明,重组转化子发酵液有明显普鲁兰酶酶活,约48h酶活达到最高水平,为2．8ASPU／mL。酶学性质分析表明,重组酶最适作用温度约为60℃,最适反应pH为5．0,60℃保温3h仍保存50％的活性。重组酶性质适合淀粉糖化工艺的要求。     

水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性评价

目的:评价水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性。方法:参照《GB/T21805-2008化学品藻类生长抑制试验》、《GB/T13266-91水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法》、《GB/T13267-91水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》、《渔药临床试验技术规范》等国家标准及相关法规,观察了解淀粉芽孢杆菌微胶囊对小球藻生长的抑制作用以及对大型蚤、斑马鱼和草鱼的急性毒性,分析了其对养殖水体主要理化因子的影响。结果:解淀粉芽孢杆菌微胶囊在终浓度为0.2～2 000mg/L时对小球藻生长具有促进作用,对小球藻的半数抑制浓度大于2 000mg/L,而且其对大型蚤、斑马鱼和草鱼的半数致死浓度也大于2 000mg/L(或mg/kg体重)。此外,在养殖水体中加入解淀粉芽孢杆菌微胶囊至终浓度为0.2～2 000mg/L后14天内,各浓度组的氨氮含量、硫化物和pH均缓慢下降,仅亚硝酸盐氮含量稍微升高后逐渐缓慢降低,但这些理化因子的变化与解淀粉芽孢杆菌微胶囊的加入量呈负相关关系。结论:解淀粉芽孢杆菌微胶囊实际无毒,对养殖水中氨氮、亚硝酸盐氮、硫化物和pH等理化因子的影响均控制在虾虎鱼仔鱼、黄颡鱼、白斑狗鱼、克氏原螯虾等水产养殖动物的安全浓度范围内,为其在水产养殖中的安全应用提供了重要的科学依据。     

解淀粉芽胞杆菌SSY1菌株的稳定性研究

目的 测定产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌SSY1株的稳定性。方法 在适宜生长条件下连续传代30代。分别取第2、10、15、20、25和30代细菌,对其进行染色镜检、生化试验、药敏试验、产纤维素酶特性及动物安全性试验。结果 传至第30代,细菌的形态、生化特性、产纤维素酶特性及药敏特性均未发生明显变化。结论 产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌SSY1株稳定性良好,有望成为中药发酵菌种。     

一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件的初步研究

从堆肥中分离到一株对植物病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有强烈抗菌活性并具有较广抗菌谱的细菌Q-12菌株。通过形态观察、生理生化实验1、6S rDNA同源性序列分析以及部分特异性基因序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌。该菌的最适培养基组成为:葡萄糖5g/L,NH4Cl 1g/L,牛肉膏0.8g/L,氯化镁5g/L。最适培养温度为33℃,最适培养pH为6.0,最适培养时间为40h。     

大熊猫肠道纤维素分解菌的分离鉴定及产酶性质

【目的】从健康大熊猫新鲜粪便中分离具有纤维素酶活性的菌株,并对其进行菌种鉴定及产酶性质研究。【方法】利用羧甲基纤维素钠培养基分离纯化具有较高纤维素酶活性的菌株,根据形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA分析对其进行分类鉴定,研究影响该菌株纤维素酶的产酶条件,以及对不同纤维素底物的降解情况。【结果】分离得到一株纤维素酶产生菌株P2,该菌株为好氧的革兰氏阳性细菌,生长温度范围20-50℃(最适温度37℃),pH范围6.0-9.0(最适pH7.0),NaCl浓度范围0%-15%(最适2%NaCl),培养24h达到产酶高峰。16S rDNA基因序列分析显示,菌株P2与解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NBRC15535相似性为99.66%。该菌株对四种纤维素底物(滤纸、脱脂棉、秸秆、竹纤维)均有不同程度的降解,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和总酶活具有不同的酶活变化。【结论】本研究首次从大熊猫粪便中分离出了好氧纤维素分解菌,并鉴定为解淀粉芽胞杆菌,对上述四种纤维结构均有一定的破坏和分解作用,为进一步研究大熊猫竹纤维消化机制提供了菌源。     

DKPs对解淀粉芽孢杆菌Q-426抗菌活性物质基因表达量的影响

目的:解淀粉芽孢杆菌Q-426在其生长过程中能够产生芬枯草菌素、依枯草菌素、枯草杆菌素等多种脂肽类抗菌物质。利用实时荧光定量PCR的方法考察细菌群体感应信号分子二酮哌嗪类化合物(diketopiperazines, DKPs)对脂肽类抗菌物质合成的调控作用。方法:当Q-426菌进入对数生长期中期,向发酵液中加入终浓度为5 mg/L的DKPs,并继续培养至48 h,并利用实时荧光定量PCR的方法进行抗菌物质mRNA表达水平的定量分析。结果:二酮哌嗪类化合物能够抑制抗菌活性物质相关基因的表达。     

表型特征结合基因组分析鉴定不同菌落形态Bacillus velezensis ACCC 19742

在中国农业微生物菌种中心(ACCC)菌株的定期转接保藏过程中,发现解淀粉芽孢杆菌ACCC 19742在同一培养基上出现两种不同的菌落形态,将这两个不同形态的菌株编号为19742-1和19742-2。通过形态学、生理生化及基因组分析相结合鉴定不同菌落形态ACCC 19742,并进一步确定该菌株的分类地位。首先将菌株进行分离与纯化,其次将纯化后的菌株进行16S rRNA及gyrB基因扩增及序列分析,通过MEGA 7.0软件构建系统发育树;API 20NE、BIOLOG及脂肪酸等分析菌株的生理生化特性;全基因组分析菌株的ANI和DDH值。两株菌在API 20NE中,仅葡萄糖酸盐同化反应存在差异;脂肪酸检测中主要组成相同,仅是百分含量方面略有差别;两株菌的16S rRNA基因相似性为100%,gyrB基因的相似性为99.4%;全基因组测序表明,两株菌的ANI值为99.95%,DDH值为99.62%。综合遗传学特征和表型特征,证实两者为来源于同一菌株不同的形态变异型,而并非污染所致。同时,19742-1和19742-2与Bacillus velezensis NRRL_B 41580~T的ANI及DDH值最高,分别为97%和77%,且16S rRNA和gyrB系统进化分析也表明,该菌株在分类地位上属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),而非解淀粉芽孢杆菌。这为菌株的保藏提供了一定的参考价值。     

Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptide subtilosin from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens

Aims: To purify and characterize an antimicrobial protein (bacteriocin) isolated from the dairy product‐derived Bacillus amyloliquefaciens. Methods and Results: An unknown bacterial species cultured from the Yogu Farm? probiotic dairy beverage was identified through 16S ribosomal RNA analysis as B. amyloliquefaciens, a phylogenetically close relative of Bacillus subtilis. The cell‐free supernatant (CFS) of overnight cultures was active against Listeria monocytogenes and also against clinical isolates of Gardnerella vaginalis and Streptococcus agalactiae. At the same time, several isolates of vaginal probiotic Lactobacilli were resistant to the CFS. The nature of the compound causing inhibitory activity was confirmed as proteinaceous by enzymatic digestion. The protein was isolated using ammonium sulfate precipitation, and further purified via column chromatography. PCR analysis was conducted to determine relatedness to other bacteriocins produced by Bacillus spp. Conclusion: The antimicrobial protein isolated from B. amyloliquefaciens was shown to be subtilosin, a bacteriocin previously reported as produced only by B. subtilis. Significance and Impact of the Study: This is the first report of intra‐species horizontal gene transfer for subtilosin and the first fully characterized bacteriocin isolated from B. amyloliquefaciens. Finally, this is the first report on subtilosin’s activity against bacterial vaginosis‐associated pathogens.     

The effect of spent mushroom compost on Lecanicillium fungicola in vivo and in vitro

Leached spent mushroom compost (SMC) and its extract were tested to suppress Lecanicillium fungicola in white button mushroom. Sterile and non-sterile mixture of SMC and peat were used to assess suppressiveness against L. fungicola in greenhouse experiments. The extract of SMC was prepared with sterile, non-sterile, filtered, supplied with nystatin, streptomycin and penicillin antibiotics to evaluate their effect in suppression of pathogen in vitro. Isolated bacteria from SMC extract were tested for antagonism rate against Lecanicillium fungicola. The results of the experiments showed that all applications rate of none-sterile SMC were effective in control of pathogen. However, the sterile SMC amendments did not have a positive effect on the pathogen suppression in vitro or in vivo, as was expected. The treatments amended with SMC 100% and 60% showed the most suppressive effect in the control of pathogen. Using of non-sterile SMC 20%, 40%, 60% and peat soil were most effective in mushroom yield. The extract of leached SMC showed inhibition of L. fungicola in petri dishes. Three bacteria isolated from extract, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Bacillus amyloliquefacien identified using 16s rRNA, showed an antagonistic effect with the fungal growth.