B7-H1和B7-H4在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)中B7-H1和B7-H4的表达及其临床意义,并为OSCC的临床诊断、治疗、判断预后及预防等提供依据。方法:采用免疫组织化学S-P法检测B7-H1及B7-H4在60例OSCC及20例非肿瘤患者正常口腔黏膜组织(NOM)中的表达情况,分析两者与OSCC临床病理特征的相关性。结果:B7-H1在OSCC组织中表达显著高于在NOM组织中表达(29例,48.3%v4例,20%,x~2=4.969,P0.05);B7-H4在OSCC组织中表达亦显著高于在NOM组织中表达(31例,51.7%v5例,25%,x~2=4.310,P0.05)。B7-H1与B7-H4在OSCC组织的表达都与TNM分期、淋巴结转移和肿瘤分化程度显著相关(P0.05),而与年龄、性别及肿瘤直径大小等无关。OSCC组织中B7-H1和B7-H4的高表达呈显著性正相关性(x~2=5.613 P0.05),60例组织中B7-H1和B7-H4共表达现象有11例(18.3%),NOM中未发现两者共表达现象。结论:B7-H1和B7-H4过表达与OSCC发生、发展及预后有关,可以作为预后指标。     

子宫内膜异位症患者血清可溶性B7-H4的水平及意义

目的:探讨子宫内膜异位症患者血清可溶性B7-H4(sB7-H4)的水平及其临床意义。方法:用ELISA夹心法检测43例子宫内膜异位症患者术前血清sB7-H4的水平及40例子宫内膜异位症患者术后血清sB7-H4的水平,同时选取30例体检健康妇女血清sB7-H4水平作为对照。结果:子宫内膜异位症患者血清sB7-H4水平为(36.23±5.67)μg/L,体检健康者血清sB7-H4水平为(31.24±4.56)μg/L,两者比较差异有统计学意义(P0.01)。手术前,子宫内膜异位症患者血清sB7-H4水平为(36.23±5.67)μg/L,明显高于术后(32.54±4.27)μg/L(P0.05)。子宫内膜异位症患者血清sB7-H4水平与CA125水平呈显著正相关(r=0.531,P0.01)。结论:血清可溶性B7-H4可能与子宫内膜异位症的发病有关,检测血清中可溶性B7-H4水平对内异症的辅助诊断和疗效观察可能具有一定的临床意义。     

共刺激因子B7-H1和B7-H3蛋白表达与胆囊癌病例特征相关

本研究选取2015年3月至2017年5月在我院保存的胆囊癌标本55例,同选取癌旁正常组织(距癌边缘>5 cm)作为对照,采用免疫组化染色检测B7-H1和B7-H3蛋白表达,分析B7-H1和B7-H3表达与胆囊癌临床病理特征和预后的关系,探讨共刺激因子B7-H1和B7-H3蛋白在胆囊癌中的表达及意义。研究结果表明:胆囊癌组织B7-H1和B7-H3蛋白阳性表达率分别为76.36%和63.63%,明显高于癌旁组织(p<0.05);B7-H1蛋白表达与胆囊癌TNM分期、淋巴结转移和侵袭深度有关(p<0.05);B7-H3蛋白表达与胆囊癌TNM分期、分化程度、淋巴结转移和侵袭深度有关(p<0.05);胆囊癌组织中B7-H1与B7-H3蛋白表达呈正相关(rs=0.516, p<0.05);B7-H1和B7-H3表达双阳性者和B7-H1或B7-H3单一表达阳性者中位总生存时间分别为20个月和21个月,明显低于B7-H1和B7-H3表达双阴性者组,差异比较有统计学意义(p<0.05)。本研究结论认为:B7-H1和B7-H3蛋白表达与胆囊癌病理特征有关系,两者间有一定相关性,且与患者预后有关。     

纳米抗体筛选技术研究进展

纳米抗体(nanobody, Nb)是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体,具有体积小、特异性强、稳定性高、易于表达和能识别隐藏的抗原表位等优势,在各个领域具有广泛的应用价值。本文介绍了纳米抗体筛选与优化过程,包括纳米抗体文库构建、体外展示和亲和力成熟3个重要技术阶段的分类与特点。其中,简要描述了天然、免疫及半合成/合成文库的制备方法与重要参数,并系统介绍了应用噬菌体、酵母、细菌、核糖体/mRNA和真核细胞等表面展示系统,以及酵母双杂交、高通量测序和质谱鉴定方法,共8种不同体外展示技术进行快速筛选的方法及其优缺点,汇总用于提升纳米抗体功能可靠性的体外及计算机辅助亲和力成熟技术平台,为综合运用各种技术手段快速获得稳定、可靠、特异的纳米抗体类药物或诊断制剂提供了参考。     

抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

B7-H4和FOXP3在乳腺癌中的表达及临床意义

目的:研究B7-H4和FOXP3在乳腺癌中的表达及其相互关系和临床意义.方法:应用S-P免疫组化法检测B7-H4蛋白和FOXP3蛋白在11例正常乳腺、25例乳腺良性病变、272例乳腺癌组织中的表达情况;运用原位杂交检查B7-H4 mRNA在10例正常乳腺、10例良性病变、20例乳腺癌组织中的表达情况.结果:B7-H4蛋白在乳腺癌中的阳性表达率(83.39%)高于乳腺良性病变组(64.00%)和乳腺正常组(54.55%),差异有统计学意义(p＜0.05);FOXP3在乳腺癌中的阳性表达率(82.67%)高于乳腺良性病变组(60.00%)和乳腺正常组(54.55%),差异有统计学意义(p＜0.05);B7-H4和FOXP3在乳腺癌中的阳性表达率与患者年龄、肿块大小和组织学分型无关(p＞0.05),而与组织学分级和淋巴结转移相关(p＜0.05);B7-H4和FOXP3在乳腺癌组织中的表达呈正相关(r=0.306,p＜0.001);B7-H4 mRNA在正常乳腺组、乳腺良性病变组、乳腺癌组中的阳性表达率差异没有统计学意义(p＞0.05);B7-H4 mRNA在乳腺癌中的阳性表达率与年龄、肿块大小、组织学分级、淋巴结转移无关(p＞0.05).结论:B7-H4和FOXP3在乳腺癌中表达上调,可能与乳腺癌的转移和预后相关.     

双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示库的构建及抗GDH纳米抗体筛选 *

目的:构建噬菌体天然纳米抗体展示库,以期用于筛选不同抗原分子的纳米抗体筛选平台,并用艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)抗原筛选靶向GDH的纳米抗体,对所构建的噬菌体天然纳米抗体展示库进行验证。方法:采用Oligo DT提取双峰骆驼脾脏总RNA进行反转录,通过巢氏PCR获取全套重链可变区基因,将其构建到噬菌粒pCANTAB5E载体,经多次电转化至E. coil TG1构建初级噬菌体抗体库,经辅助噬菌体拯救后构成噬菌体展示库,并对噬菌体展示库的库容及多样性进行分析和鉴定。同时以GDH为靶向抗原对文库进行淘筛,计算淘筛回收率,并对第三轮淘筛后平板的单克隆进行ELISA鉴定。结果:构建的天然噬菌体纳米抗体库的插入率为95%左右,随机挑取的9个克隆氨基酸同源性为66. 17%,经MEGA分析后具有较好的多样性,同时经辅助噬菌体拯救后,得到的噬菌体展示库滴度为4×10~(12)CFU/ml。在三轮淘筛过程中,回收率逐步升高,噬菌体得到了有效的富集,同时对阳性克隆进行测序及分析,最终得到2条抗GDH纳米抗体序列。结论:成功构建了双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库且多样性良好,为后续筛选其他的靶向抗原奠定了基础,同时筛选获得两条抗GDH纳米抗体序列,为制备艰难梭菌谷氨酸脱氢酶诊断抗体提供技术支撑。     

抗GM-CSF纳米抗体的筛选与鉴定

目的:制备抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)纳米抗体,并测定其亲和力.方法:分离提取GM-CSF免疫后羊驼外周血淋巴细胞总RNA,PCR扩增得到纳米抗体基因片段,与载体pHEN1重组后克隆至大肠杆菌TG1以构建初始文库,经拯救构建得到噬菌体展示纳米抗体文库,并对其进行生物淘选;通过大肠杆菌BL21(DE3)...     

纳米抗体技术及其在疾病诊断和治疗中的应用

单克隆抗体具有特异性结合抗原的能力,已被广泛应用于疾病诊断及治疗领域.但因单克隆抗体的组织渗透能力较差、体内的保留时间较长以及制备过程繁琐,从而限制了其在临床中的应用.自1993年首次报道在骆驼体内天然存在的单链抗体(HCAb)以来,由于其可变区间VHH(纳米抗体)具有体积小、溶解度高、特异性强以及可在细菌中大量表达等优点,较之传统单克隆抗体,VHH在疾病的诊断治疗及药物开发等医学领域具有更广阔的应用前景.本文综述了:纳米抗体的骨架区及互补决定区与传统抗体重链相应区间的结构比较;纳米抗体库的构建以及运用噬菌体展示技术对VHH库的筛选;纳米抗体技术在疾病诊断中的应用及其用于分子显像的优势,以及纳米抗体作为抗肿瘤免疫偶联物的靶向组分在癌症治疗领域中的最新进展.     

Increasing the potency of neutralizing single-domain antibodies by functionalization with a CD11b/CD18 binding domain

Recombinant single domain antibodies (nanobodies) constitute an attractive alternative for the production of neutralizing therapeutic agents. Their small size warrants rapid bioavailability and fast penetration to sites of toxin uptake, but also rapid renal clearance, which negatively affects their performance. In this work, we present a new strategy to drastically improve the neutralizing potency of single domain antibodies based on their fusion to a second nanobody specific for the complement receptor CD11b/CD18 (Mac-1). These bispecific antibodies retain a small size (˜30 kDa), but acquire effector functions that promote the elimination of the toxin-immunocomplexes. The principle was demonstrated in a mouse model of lethal toxicity with tetanus toxin. Three anti-tetanus toxin nanobodies were selected and characterized in terms of overlapping epitopes and inhibition of toxin binding to neuron gangliosides. Bispecific constructs of the most promising monodomain antibodies were built using anti Mac-1, CD45 and MHC II nanobodies. When co-administered with the toxin, all bispecific antibodies showed higher toxin-neutralizing capacity than the monomeric ones, but only their fusion to the anti-endocytic receptor Mac-1 nanobody allowed the mice to survive a 10-fold lethal dose. In a model of delayed neutralization of the toxin, the anti- Mac-1 bispecific antibodies outperformed a sheep anti-toxin polyclonal IgG that had shown similar neutralization potency in the co-administration experiments. This strategy should have widespread application in the development of nanobody-based neutralizing therapeutics, which can be produced economically and more safely than conventional antisera.     

抗脂多糖纳米抗体的筛选及其五聚体的制备

目的：筛选抗脂多糖（LPS）纳米单域抗体,并制备抗LPS纳米抗体五聚体。方法：以LPS为抗原,从驼源天然单域重链抗体库中筛选抗LPS纳米抗体,利用分子克隆技术将抗LPS单域抗体基因组装入志贺杆菌样毒素B亚基蛋白结构域（VTB）的五聚体特异性表达载体中进行可溶性表达,并用ELISA法鉴定所获抗体的抗原结合活性和特异性。结果：获得抗LPS纳米单域抗体及LPS纳米抗体五聚体;经鉴定,LPS纳米抗体五聚体的抗原结合活性优于抗LPS单域抗体。结论：利用驼源天然单域重链抗体库制备了抗LPS纳米单域抗体及抗LPS纳米抗体五聚体,为脓毒血症的分子诊断、预后判断及寻找生物治疗新靶点奠定了基础。     

B7家族的新成员

T细胞的活化需要共刺激分子和其受体及特异性抗原与T细胞受体的双信号作用。B7家族成员是重要的共刺激分子,除B7－1和B7－2,新近又发现了一些新成员：B7RP－1（又名B7h,GL50或ICOSL）为鼠ICOS（inducible costimulator,CD28家族的第三位成员）的配体,其人的同源物命名为B7－2（也称为GL50或ICOSL）,它对TG细胞生长及细胞因子产生的共刺激作用已明显,B7－H1（也称PD－1L）,B7H3是一类不与ICOS结合的B7家族新成员。现已证实。现已证实,这些分子与其受体之间的作用在T细胞增殖及发挥效应中扮演重要角色,它们在许多疾病中的作用也引起学者的普遍关注。     

β-伴大豆球蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

大豆是一种重要的植物蛋白质来源,在幼儿和幼小动物具有较高的过敏性,尤其是其中的β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）,约占大豆总蛋白质的30%,是主要的过敏原。传统的ELISA检测方法依赖于多克隆抗体或单克隆抗体,这些抗体分子量大,难以接触核心区域,且对酸碱敏感,限制了快速检测的应用。纳米抗体（nanobodies, Nbs）源自驼科动物的重链抗体可变区,具有体积小、结构稳定、特异性强和亲和力高等优点。本研究旨在研制β-伴大豆球蛋白的纳米抗体,使用β-伴大豆球蛋白对羊驼进行5次免疫,ELISA检测显示,其重链抗体效价为1∶16 000;随后分离外周血淋巴细胞并提取总RNA,通过PCR扩增重链抗体的可变区,构建重组质粒并转化至ER2738感受态,获取Nbs噬菌体展示文库。该文库的库容约为3.5×10～8 CFU/mL,经辅助噬菌体拯救后达到1.15×10¹² PFU/mL,Nbs基因插入率为100%。通过4轮固相筛选,其纳米抗体噬菌体输出明显富集,富集率为155.9;Phage-ELISA结果显示,筛选出35株阳性克隆,测序结果显示,均为同一氨基酸序列。将该Nbs进行原核表达,通过Western印迹和ELISA验证其对β-伴大豆球蛋白具有良好的结合能力。这一研究为开发Nbs的β-伴大豆球蛋白快速检测方法奠定基础。