红豆杉植株紫杉醇含量研究进展(综述)

影响红豆杉中紫杉醇含量的因素较多。为了提高红豆杉紫杉醇及其衍生物的含量,国内外已开展大量研究,其中多数是以天然红豆杉为研究对象。研究表明,不同种类、树龄、器官、物候期、生长环境等因子对天然红豆杉中紫杉醇含量均有影响。本文综述了影响红豆杉紫杉醇含量的各种因子,并对紫杉醇测定方法、天然红豆杉与人工红豆杉中紫杉醇含量以及红豆杉中其它紫杉烷类化合物含量等进行了比较。     

云南红豆杉愈伤组织培养及其生产紫杉醇的研究

从红豆杉科红豆杉属植物如短叶红豆杉（Ｔａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）等的树皮或枝叶提取到的紫杉醇（Ｔａｘ-ｏｌ）是一种具有强抗癌活性的二萜烯类化合物^[1].作为一种治疗晚期卵巢癌、乳腺癌的新药已经在欧美等一些国家被批准上市,成为迄今从植物中提取的最有效的抗癌药之一^[2].但由于紫杉树皮来提取紫杉醇的方法如紫杉醇的化学合成、半合成,从真菌中提取紫杉醇以及改善红豆杉的栽培措施等等均已取得了较大进展,但离实际应用还相差太远^[5,6].而利用组织和细胞培养方法替代砍伐天然红豆杉树皮来提取紫杉醇,也已成为近几年来红豆杉研究的一个重要课题之一并已取得了较大进展^[7].云南红豆杉（Taxus yunnanensis）主要分布于我国云南省,是分布于我国的主要品种之一,其含量在我国现有的几种红豆杉植物中属于较高的一种^[3],在我国,近些年来亦有不少实验室在红豆杉细胞培养方面取得了较好的成绩,但文献报道的较少^[8-10].本文报道利用云南红豆杉细胞培养方法来生产紫杉醇,以最终取代从天然来源的树皮和枝叶中提取的可能性,对云南红豆杉进行的愈伤组织的诱导和培养研究的进展。     

诱导子对红豆杉培养细胞紫杉醇产量的影响

利用红豆杉细胞培养技术生产紫杉醇是目前紫杉醇生产的研究热点之一,并已取得了较大进展,其中如何提高紫杉醇的产量是研究的关键。目前通过促进紫杉醇代谢来提高产量最常用、最重要的方法之一是添加诱导子。这是来源于病原微生物的一类化学物质,具有诱导植物细胞中防卫基因表达诱发植物过敏反应和促进植物细胞中特定次生代谢产物的合成等多种功能。就近年来在红豆杉细胞培养生产紫杉醇方面的研究进展进行简要论述,着重介绍了添加诱导子在促进紫杉醇生物合成中的应用。     

改进的HPLC法测定红豆杉植物和细胞培养物中紫杉醇的含量

紫杉醇 (Ｔａｘｏｌ)是一种新型的抗癌药物。由于紫杉醇在红豆杉属 (ＴａｘｕｓＬ .)植物中的含量很低 ,而且运用植物细胞培养技术生产紫杉醇仍处实验阶段 ,因此 ,对于紫杉醇含量甚微的样品 ,寻找一种精确、灵敏、快速的检测方法就显得尤为重要。本实验采用改进的ＨＰＬＣ法对南方红豆杉〔Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｍａｉｒｅｉ (Ｌｅｍｅ啨ｅｔＬ啨ｖｌ.)ＣｈｅｎｇｅｔＬ .Ｋ .Ｆｕ〕枝和叶 ,以及中国红豆杉〔Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ (Ｐｉｌｇｅｒ)Ｒｅｈｄ .〕细胞培养物中的紫杉醇含量进行了测定。1　实验方法1 1　实…     

云南红豆杉培养细胞系的建立

紫杉醇(Taxol)最初是从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离出的一种二萜类化合物^[1]．对卵巢癌,转移性乳腺癌和恶性黑色寮瘤等患者疗效显著^[2],全世界红豆杉属植物有近11种,都含紫杉醇成分．但含量很低,加之现存数量很少,生长极为缓慢．造成了紫杉醇原料供应的危机^[3]。紫杉醇化学合成已经成功^[4-6],但繁杂的反应过程及前体化合物来源的限制使得它们无法实现商业化生产。最近从短叶红豆杉中分离出一种生产紫杉醇的内寄生真菌Tgromyer andreanae^[7]．由于紫杉醇含量仅为24～50ng/L．没有实用价值。植物细胞和组织培养可能是解决天然抗肿瘤药物长期供应的有效方法之一^[8]。自1991年Christen等人申请利用红豆杉细胞培养物生产紫杉醇专利以来^[9]．有关红豆杉细胞培养的研究已有不少报^[10-12]。但云南红豆杉(T.yunnanensis)仅见愈伤组织诱导的报道^[13]。本文报道云南红豆杉愈伤组织诱导和细胞培养的初步结果,并分析了细胞培养物中紫杉醇含量。     

红豆杉高产悬浮细胞系建立及其紫杉醇诱导的研究进展

紫杉醇是一种四环二萜酰胺类化合物,是从红豆杉科红豆杉属植物中提取分离出来的次生代谢物,是世界公认广谱、活性强的天然抗癌新药。但直接从植物中提取紫杉醇的传统生产方式,不仅产量低,且会对野生红豆杉资源造成严重破坏,同时紫杉醇的化学全合成也由于其结构复杂而不具备商业价值。与之相反,细胞培养技术具有受外界影响少、生产成本低、次生代谢产物多、细胞生长周期短的优势,是目前最具前景的紫杉醇生产方式。近年来随着科研水平的不断提升,紫杉醇无论在生理代谢调控、关键基因挖掘,还是新药物制剂与剂型及其类似物的开发和运用等方面,都取得了进展,但要建立紫杉醇商业化高产体系,还必须和前人的研究经验相结合。该文对红豆杉高产悬浮细胞系建立及其紫杉醇诱导的研究进展进行了综述,主要包括前人对红豆杉属植物组织与细胞培养相关的外植体、培养基、激素、培养条件、褐化等问题的研究,以及从代谢调节、培养方式、基因工程等多方面提高紫杉醇含量的最新进展,最后总结了当前研究的不足,并对今后通过多种组合方式来提高紫杉醇含量的生产途径进行了展望。以期促进红豆杉组织培养技术的进步,为药用资源保护和利用提供一定的理论基础与生产指导。     

茉莉酸甲酯对中国红豆杉胚性细胞紫杉醇生物合成的影响

紫杉醇(taxol)是一种复杂的二萜类生物碱,最初是从红豆杉类(Taxus)植物的树皮中分离出来的。紫杉醇作为具有广谱抗肿瘤活性的药物而得到广泛的临床应用,成为当今世界上有效的抗癌药物之一,但其天然资源十分稀少,解决其药源问题就显得非常重要。目前,普遍认为采用红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇是很有希望的途径之一。而提高红豆杉细胞生长速率以及细胞中紫杉醇的含量是实现细胞悬浮培养生产紫杉醇的两个关键因素,笔者研究了茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,简称MJ)在红豆杉细胞培养中的代谢调节作用。茉莉酸甲酯是茉莉属(Jasminum)中的素馨花…     

Clomazone对中国红豆杉细胞培养的影响

以中国红豆杉（Taxus chinensis）悬浮细胞为材料,研究了Clomazone（广灭灵）对培养细胞生长及紫杉醇和糊胡萝卜素合成的影响。探讨紫杉醇生物合成途径人工调控的方法。结果表明在细胞培养第20d加终浓度为20mg/L的Clomazone,对细胞生长影响较小,紫杉醇含量最高,达4263μg/L,约为对照的3倍。Clomazone可以抑制红豆杉细胞类胡萝卜素的合成,其对紫杉醇产量的提高可能与其抑制类胡萝卜素的合成有关。Clomazone与Methyl jasmorale (MJ)及Chloroholine chloride（CCC）对紫杉醇含量的提高有协同作用。     

应用电导率监测红豆杉细胞悬浮培养中细胞生长与紫杉醇的累积

对中国红豆杉细胞悬浮培养过程中细胞生长和紫杉醇累积及培养液的电导率变化规律进行了研究,实验表明,细胞悬浮培养过程中随着细胞生物量与紫杉醇含量的增加,培养液的电导率逐渐下降,细胞生长和紫杉醇累积曲线与培养液的电导率曲线恰成镜像相关,当生物量达到最高时电导率达到并稳定于最低;紫杉醇累积的高峰滞后于细胞生物量的高峰2～3 d;电导率可作为红豆杉细胞培养中确定生物量和紫杉醇累积高峰期的监测指标.     

红豆杉细胞稳定生产紫杉醇中的同步化协同诱导作用

同步化协同诱导可以稳定提高曼地亚红豆杉细胞培养物中紫杉醇含量。细胞培养周期第8d的低温同步化处理可促使细胞达到最高同步化率（20.4%）,而茉莉酸甲酯（MJ）的协同诱导可提高紫杉醇产量,使紫杉醇产量最高值达到54.7mg·L^-1。在细胞生长周期第8d,未经低温同步化的红豆杉细胞中的关键酶基因DXR、HMGR、GGPPS和DBAT的表达量在MJ诱导24h后均迅速下降,但在低温同步化的细胞中紫杉醇表达量下降缓慢,60h后仍维持较高的水平。低温同步化和MJ协同诱导的红豆杉细胞中,紫杉醇合成关键酶基因高效稳定的表达可能是引起紫杉醇产量稳定提高的原因之一。     

补料培养与溶氧控制联合应用对红豆杉细胞培养的影响

为进一步提高红豆杉 (Taxuschinensis (Pilg.)Rehd .)细胞培养过程中紫杉醇的产量 ,采用细胞悬浮培养方法研究了补料培养与溶氧控制联合应用对紫杉醇产量的影响。 5L反应器中补料培养研究表明 ,培养过程中第 16天添加含 2 0g/L蔗糖的补料培养液有利于细胞的生长及紫杉醇的合成。 2 0L反应器中补料培养的研究结果表明 :2 0 %饱和度培养时紫杉醇含量最高 (0 .98mg/gDW) ,但 4 0 %～ 6 0 %溶氧饱和度能提高紫杉醇的产量。进一步研究表明 ,细胞在 6 0 %溶氧饱和度培养 2 0d后转入 2 0 %溶氧饱和度继续培养 12d ,能显著提高紫杉醇产量。补料培养与溶氧控制联合应用时 ,2 0L反应器中红豆杉细胞培养紫杉醇产量可达 18.7mg/L。     

红豆杉悬浮细胞放大培养的细胞生长与紫杉醇合成动力学

研究了在Murashige&skoog s(MS)和 6 2号两种不同的培养基中 ,红豆杉细胞悬浮细胞从摇瓶到 1 0L机械通气搅拌式反应器放大培养过程中细胞生长与紫杉醇合成动力学 .结果表明 :尽管在不同的培养条件下 ,细胞生长曲线均呈现“S”型 .紫杉醇在延迟期与指数生长期中基本上没有积累 ,而且随着培养规模的增大 ,紫杉醇的含量逐渐降低 .进一步对各级放大培养的细胞生长 ,比生长率与胞内外紫杉醇合成量进行分析 ,发现MS利于细胞生长但不利于紫杉醇合成 ,而 6 2号则相反 .根据此文的结果 ,提出了红豆杉细胞培养条件的优化和大规模细胞培养生产紫杉醇应采取的策略     

紫杉类化合物研究进展

自本世纪70年代从欧洲红豆杉树皮中提取分离得到具有抗癌活性的天然产物紫杉醇以来,关于红豆杉属植物的研究已取得了许多进展。本文就1990年以后发表的有关文献。对该属植物的化学成分研究、合成方法、细胞培养技术及构效关系研究进行综述。     

补料培养与溶氧控制联合应用对红豆杉细胞培养的影响

为进一步提高红豆杉(Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.)细胞培养过程中紫杉醇的产量,采用细胞悬浮培养方法研究了补料培养与溶氧控制联合应用对紫杉醇产量的影响.5 L反应器中补料培养研究表明,培养过程中第16天添加含20 g/L蔗糖的补料培养液有利于细胞的生长及紫杉醇的合成.20 L反应器中补料培养的研究结果表明:20%饱和度培养时紫杉醇含量最高(0.98 mg/g DW),但40%～60%溶氧饱和度能提高紫杉醇的产量.进一步研究表明,细胞在60%溶氧饱和度培养20 d后转入20%溶氧饱和度继续培养12 d,能显著提高紫杉醇产量.补料培养与溶氧控制联合应用时,20 L反应器中红豆杉细胞培养紫杉醇产量可达18.7 mg/L.     

曼地亚红豆杉细胞系的建立与评价

红豆杉(Taxus)细胞内紫杉醇的含量低且不稳定,限制了利用细胞培养大规模生产紫杉醇的产业化进程。以紫杉醇含量较高的曼地亚红豆杉(Taxus m edia)为试材,诱导得到了曼地亚红豆杉愈伤组织,在添加抗坏血酸(VC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭(activated carbon)的改良B5培养基上,15次反复继代培养后获得了高产紫杉醇的细胞系。对新建立的曼地亚红豆杉细胞系(MC)与同期诱导的东北红豆杉细胞系(NC)及实验室继代多年的中国红豆杉细胞系(SC)在细胞生长周期、紫杉醇含量和细胞死亡率等方面进行了分析比较。结果表明,SC的生长量达5.9倍,高于MC和NC的3.6和4.2倍。在初始接种量相近的情况下,MC的悬浮培养细胞在一个周期内紫杉醇产量可达9.5 mg/L,经过茉莉酸甲酯(M J)诱导后可达到41 mg/L。     

内生真菌紫杉醇生物合成的研究现状与展望（英文）

紫杉醇是重要的抗癌药物之一,已经证明其对多种癌症具有显著疗效。目前,人们主要是从红豆杉的树皮中提取、分离和纯化紫杉醇,但由于红豆杉为生长缓慢、散生、濒危的珍稀植物,且随着紫杉醇临床用途的不断拓宽,市场需求的稳定增长,单纯依靠从红豆杉树皮中提取紫杉醇已经无法满足日益增长的市场需求。为了解决紫杉醇的药源不足,科学家已把目光从红豆杉树分离提取紫杉醇转向了其他替代方法,如化学全合成、半合成、组织培养与细胞培养、微生物发酵法生产紫杉醇等。因此,了解内生真菌紫杉醇生物合成的分子基础和遗传调控机制,对解析内生真菌紫杉醇生物合成机制、构建高产紫杉醇基因工程菌株和早日实现内生真菌紫杉醇工业化生产具有重要的科学意义和现实意义。结合本课题组多年来的科研工作,概述了红豆杉细胞紫杉醇生物合成途径、内生真菌发酵生产紫杉醇的优势、产紫杉醇内生菌的分离研究现状和生物多样性及紫杉醇生物合成相关基因的研究现状。内生真菌生物发酵合成紫杉醇是可以无限生产、大量获取紫杉醇、解决紫杉醇药源短缺问题的很有前景的方法之一。     

内生真菌紫杉醇生物合成的研究现状与展望

紫杉醇是重要的抗癌药物之一,已经证明其对多种癌症具有显著疗效。目前,人们主要是从红豆杉的树皮中提取、分离和纯化紫杉醇,但由于红豆杉为生长缓慢、散生、濒危的珍稀植物,且随着紫杉醇临床用途的不断拓宽,市场需求的稳定增长,单纯依靠从红豆杉树皮中提取紫杉醇已经无法满足日益增长的市场需求。为了解决紫杉醇的药源不足,科学家已把目光从红豆杉树分离提取紫杉醇转向了其他替代方法,如化学全合成、半合成、组织培养与细胞培养、微生物发酵法生产紫杉醇等。因此,了解内生真菌紫杉醇生物合成的分子基础和遗传调控机制,对解析内生真菌紫杉醇生物合成机制、构建高产紫杉醇基因工程菌株和早日实现内生真菌紫杉醇工业化生产具有重要的科学意义和现实意义。结合本课题组多年来的科研工作,概述了红豆杉细胞紫杉醇生物合成途径、内生真菌发酵生产紫杉醇的优势、产紫杉醇内生菌的分离研究现状和生物多样性及紫杉醇生物合成相关基因的研究现状。内生真菌生物发酵合成紫杉醇是可以无限生产、大量获取紫杉醇、解决紫杉醇药源短缺问题的很有前景的方法之一。     

聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产的影响

在改良的B5培养基中加入不同浓度的聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞进行摇瓶培养,通过不同时期取样并测定细胞鲜,干重及用HPLC测定紫杉醇的含量,发现聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产均有明显的促进作用,聚乙二醇为10g/L时,对细胞生长最为有利,细胞培养16d可达到最大生物量,其平均鲜重为28．73g/瓶,增重3．8倍,平均干重为2．14g/瓶,增重3．1倍,聚乙二醇为20g/L,对紫杉醇的生产最有利;细胞培养25d时,培养基中紫杉醇的含量达到最高水平,其含量为2350ug/L,是不加聚乙二醇的11倍。     

三种不同颜色果实的红豆杉树皮中紫杉醇含量比较研究

本研究比较了三种安徽宣城采集的不同颜色果实的红豆杉树皮中紫杉醇的含量。利用三氯甲烷料液比1:5,回流提取2 h,活性炭脱色后制备供试品溶液。采用HPLC法,Agilent HC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-水-乙腈(24:30:36)为流动相,在227 nm波长下检测紫杉醇含量。检测发现红豆杉树皮中紫杉醇含量为0.000 564 mg/g,黄色果实红豆杉树皮中紫杉醇含量为0.000 785 mg/g,金黄色果实红豆杉树皮中紫杉醇含量为0.000 703 mg/g。安徽宣城发现的黄色果实红豆杉和金黄色果实红豆杉树皮中的紫杉醇含量比红豆杉高,初步明确了黄色果实红豆杉的药用价值,为进一步发掘其产品价值提供了依据。     

植物内生真菌产紫杉醇的研究*

紫杉醇（Ｔａｘｏｌ,商品名Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）最早是由美国Ｗａｎｉ等于１９７１年分离自短叶红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）的茎皮部［１］,具有独特的抑制微管解聚和稳定微管的作用,对多种临床恶性肿瘤具有突出的疗效,是近年来发现的最重要的抗肿瘤药物之一。随着紫杉醇的需求量日益增大,寻找紫杉醇的新来源已成为当务之急,如化学合成紫杉醇的研究［１］,以１０－去乙酰巴卡亭Ⅲ为原料半合成紫杉醇［３］,利用红豆杉细胞培养技术生产紫杉醇等,但目前尚不具备实用价值。自发现了产紫杉醇的植物内生真菌以后［４…