基于16S rRNA和RubisCO基因对嗜酸硫杆菌的系统发育及多样性北大核心CSCD

【目的】明确不同地理来源的Acidithiobacillus spp.种群是否表现出显著的地域性和异域物种形成;为了解微生物谱系地理、多样性维持机制和微生物分子地理学提供基础数据。【方法】采用16S r RNA基因、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubis CO)功能基因序列同源性分析构建相应的系统发育树,分析Acidithiobacillus spp.种群的遗传多样性。【结果】从3个不同的地域分离到35株菌聚为5大类群,其中菌株YNTR4-15可能是铁氧化细菌(Leptspirillum ferrooxidans),菌株HBDY3-3被鉴定为另一铁氧化细菌(Leptospirillum ferrodiazotrophum);有4株可能是Acidithiobacillus ferrivorans;6株是Acidithiobacillus ferridurans,其余菌株均被鉴定为Acidithiobacilus ferrooxidan。对26株代表性菌株的Rubis CO I型cbb L基因和II型cbb M基因的分析,发现19株菌具有双拷贝cbb L基因,分别为cbb L1和cbb L2基因;7株菌只检测到了cbb L1。cbb L1和cbb L2基因都有3个序列型;而cbb M基因是单拷贝。Rubis CO基因的密码子偏爱性不强。【结论】分离自3个地域的菌株16S r RNA/Rubis CO基因存在序列差异,Acidithiobacillus spp.种群存在显著的遗传多样性。嗜酸硫杆菌分离菌株基于16S r RNA基因的系统发育树和Rubis CO基因的发育树不一致。     

八门湾红树林土壤芽胞杆菌分离与多样性分析

【目的】了解八门湾红树林海漆林区土壤中可培养芽胞杆菌资源的多样性。【方法】采用水浴处理与直接涂布相结合的方法选择性分离土壤中的芽胞杆菌;利用16S rDNA PCR-RFLP与16S rDNA序列分析技术研究可培养芽胞杆菌资源的遗传多样性和系统发育关系。【结果】16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱UPGMA聚类分析表明,在100%的相似性水平上,分离的155株芽胞杆菌分属21个遗传类群,显示了较为丰富的遗传多样性;由21种遗传类型代表菌株的16S rDNA序列分析结果得知,这些芽胞杆菌主要分布在Bacillaceae和Paenibacillaceae科下的Bacillus、Halobacillus、Virgibacillus和Paenibacillus 4个属,其中Bacillus为优势属;有8株芽胞杆菌的16S rDNA序列与数据库中相应模式菌株的最大相似性在95.1%-99.0%之间。【结论】八门湾红树林土壤可培养芽胞杆菌有着较为丰富的遗传多样性,并存在新的芽胞杆菌物种资源。     

四川省二化螟不同地理种群遗传多态性的差异分析

【目的】为了解四川省二化螟Chilo suppressalis (Walker)不同地理种群的遗传结构,分析各个种群间的亲缘关系,为区域治理对策提供新的依据。【方法】通过测定四川省17个市县二化螟样本的线粒体COⅡ基因和核糖体ITS基因,利用MEGA软件分析二化螟不同地理种群的基因遗传多样性,以获取样本群体遗传多样性信息。【结果】对114条幼虫线粒体COⅡ基因序列分析发现,在500 bp的区段中共有147个位点存在多态性,包含33个单倍型;川东地区和川西地区二化螟种群的单倍型多样度分别为0.703 83和0.802 26;系统发育树显示,除眉山-1-1种群之外,其他二化螟地理种群聚合为一个大分支。而对同批二化螟核糖体ITS基因序列分析结果表明,在533 bp的区段中存在299个位点多态性,有92个单倍型;川东地区和川西地区二化螟种群的单倍型多样度分别为0.967 48和0.975 71;在系统发育树中,犍为种群聚合为一支,其余种群聚合为一支。【结论】川西地区二化螟线粒体COⅡ基因和核糖体ITS基因多态性比川东地区样本丰富。地理种群之间的遗传分化与分布之间的相关性不大,这可能与种群本身差异相差不大相关。     

一株嗜酸硫杆菌M4-422-6的分离及其全基因组测序和比较基因组学分析

【目的】开展具有硫氧化能力的嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)的分离及其比较基因组学分析,不仅可以丰富硫氧化细菌菌种资源,而且有助于加深理解嗜酸硫杆菌的分子进化与生态适应机制。【方法】利用以硫代硫酸钠为唯一能源的培养基分离具有硫氧化能力的细菌;利用Illumina HiSeq X和Oxford Nanopore测序平台对一株嗜酸硫杆菌M4-422-6进行全基因组测序;利用相关生物信息学分析软件对原始数据进行组装和基因组注释,并与一株亲缘关系最近的菌株Igneacidithiobacillus copahuensis VAN18-1进行比较基因组学分析。【结果】分离获得一株具有硫氧化能力的嗜酸硫杆菌M4-422-6。基因组注释结果显示,菌株M4-422-6基因组由1个染色体和2个质粒组成,基因组大小为2 917 823 bp,G+C含量为58.54%,共编码2 925个蛋白。16S rRNA基因和基因组系统发育树显示,菌株M4-422-6代表嗜酸硫杆菌属的一个潜在新种。功能基因注释结果显示,菌株Acidithiobacillus sp. M4-422-6拥有与菌株特性相关的众多基因,包括硫氧化相关基因、CO₂固定相关基因和耐酸相关基因。比较基因组学分析发现,虽然菌株M4-422-6与VAN18-1的亲缘关系最近,但两者仍拥有众多的差异基因,主要包括噬菌体抗性相关基因和移动元件编码基因。【结论】菌株M4-422-6代表嗜酸硫杆菌属的一个潜在新种,该菌株具有同种内菌株所不具有的特有基因,并据此推测嗜酸硫杆菌种内分化可归因于对特定生态位的适应。     

药用植物内生芽孢杆菌的多样性和系统发育研究

[目的]了解药用植物内生芽孢杆菌的生物多样性.[方法]采用数值分类、16S rDNA PCR RFLP、BOX-PCR指纹图谱和16S rDNA序列分析技术对分离于几种药用植物的内生芽孢杆菌和已知参比菌株进行表型、遗传多样性及系统发育研究.[结果]供试菌株在数值分类聚类分析中在84%的相似水平上产生13个表观群.16S rDNAPCR-RFLP分析表明供试菌株表现出丰富的遗传多样性.BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明药用植物的内生芽孢杆菌的基因组也具有多样性,聚群的结果与数值分类有较好一致性.用软件在Genbank中进行所得序列的同源性检索,并构建系统发育树.由16S rDNA序列分析可知,供试的代表菌株SCAU11与球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)亲缘关系最近,SCAU78和SCAU25为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的两个亚种,代表菌株SCAU39与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的亲缘关系最近.[结论]研究结果表明药用植物内生芽孢杆菌具有明显的表型和遗传多样性.     

老芒麦和垂穗披碱草rDNA-ITS序列分析

分析了老芒麦和垂穗披碱草rDNA-ITS序列,为这两个种的鉴别提供分子指纹图谱,为系统发育提供分子生物学依据。结果表明,22份材料的ITS、ITS1、5.8S、ITS2序列长度均相同,依次为604bp、222bp、164bp、218bp,GC含量依次为62.25%～63.08%,62.16%～63.06%,59.76%,64.22%～65.60%。除5.8S外,碱基位点都有不同程度的变化,一些变异位点有明显的种性变异规律,可作为老芒麦和垂穗披碱草种质DNA指纹特异鉴别位点。7个ITS序列的同源性98.7%～99.8%,遗传分歧0.2～1.3,具有保守性,为非近期分化类群。系统发育分析表明不同来源地的同种材料,差异主要表现在DNA变化快慢及碱基替换数,但相同的种归为一类,进一步反映了种内的遗传稳定性。     

基于ITS条形码序列的刺桐姬小蜂分子鉴定

【目的】刺桐姬小蜂Quadrastichus erythrinae Kim体型小,传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。【方法】本研究测定了刺桐姬小蜂的rDNA ITS1和ITS2序列,根据18S rDNA部分序列,利用MEGA的最大相似法(Maximum Likehood)构建系统发育树。根据刺桐姬小蜂ITS1和ITS2序列设计了特异引物,应用特异引物对单只刺桐姬小蜂进行PCR扩增,可稳定地扩增出明显的目的DNA条带。【结果】研究表明,基于ITS基因的DNA条形码技术可以用于刺桐姬小蜂的快速准确鉴定。【结论】因此,采用ITS1和ITS2区的特异性引物可对刺桐姬小蜂进行快速分子鉴定。     

美国西部不同地区Grayia spinosa核DNA ITS序列分析

藜科植物Grayia spinosa是美国西部地区的特有种,多生长在干旱盐碱地,具有重要的生态价值。该研究测定了采自美国西部犹他州G.spinosa的nrDNA ITS序列,与Gen Bank中已提交的G.spinosa的所有ITS序列以及G.spinosa的四个近缘种作为外类群进行比较,分析了美国西部不同地区G.spinosa ITS序列的一级结构与其RNA二级结构的变异规律。结果表明:所有G.spinosa样品的nrDNA ITS序列长度在611~623 bp之间,GC含量在60.35%~61.0%之间,序列间共存在22个变异位点,5个为简约信息位点。各样品间的遗传距离在0.001 8~0.008 9之间,不同样品间的遗传距离与地理距离的相关性不显著。邻接法构建的系统发育树显示所有G.spinosa聚为一大支,与外类群形成明显分支。此外,利用RNAfold在线软件预测了G.spinosa ITS序列的RNA二级结构,将8个G.spinosa样品的RNA二级结构根据构型差异大体上分为四类,分别记为type A,B,C和D四类,主要变异出现在ITS1和ITS2区。所不同的是在G.spinosa ITS的一级结构分析中GSNE1与GSWA8体现出更近的亲缘关系,但二者的RNA二级结构差异明显,同时GSNE2、GSUT3、GSUT4、GSCA5、GSCA6、GSCO7在ITS序列一级结构分析中也体现出较近的亲缘关系,但是他们的RNA二级结构差异明显。这可能与ITS序列的RNA二级结构在进化中体现出更大的保守性有关。     

中国库蚊属四十个种(亚种)的分子系统发育关系研究(双翅目:蚊科)

【目的】对在中国有分布的库蚊属Culex种(亚种)的COⅠ序列和ITS2序列进行测序,构建和讨论这些种(亚种)的分子系统发育关系。【方法】测定了库蚊属20个种(亚种)的COⅠ和ITS2序列,并从NCBI数据库中下载了库蚊属另外20个种(亚种)的COⅠ和3个种(亚种)的ITS2序列。对库蚊属40个种(亚种)的COⅠ序列和其中23个种(亚种)的ITS2序列进行碱基构成、种间遗传距离和饱和度分析,并对COⅠ+ITS2序列进行ILD(incongruence length difference)检验。分别使用2种分子数据集(COⅠ和ITS2)的核苷酸序列,用最大似然法(ML)、贝叶斯法(BI)、邻接法(NJ)和最大简约法(MP)推断这些种的系统发育关系。通过Kishino-Hasegawa(KH)和ShimodairaHasegawa(SH)检验评估这4种系统树间的差异,确定最为合理的系统发育树。【结果】本研究新测序获得20种(亚种)的COⅠ和ITS2序列的长度范围分别为625~685 bp和300~559 bp。COⅠ和ITS2序列在库蚊属成对蚊种间的遗传距离分别是0.002~0.198和0.006~1.807。库蚊属23个种(亚种)的COⅠ+ITS2序列的ILD检验结果显示,数据集具有不相容性,因此COⅠ+ITS2序列不适用于这些种(亚种)的系统发育研究。经KH和SH检验显示,4种系统发育树中,基于COⅠ序列构建的BI树最为合理,而基于ITS2序列构建的MP树最为合理。基于COⅠ核苷酸序列所构建的BI树显示,除幼小库蚊Cx.infantulus和短须库蚊Cx.brevipalpis外,各亚属间成员聚类结果与传统的形态学归类结果吻合;路蚊亚属Lutiza和包蚊亚属Barraudius都归入库蚊亚属Culex内;梅蚊亚属Maillotia和新库蚊亚属Nexoculex聚为一支;库状蚊亚属Culiciomyia、真黑蚊亚属Eumelanomyia和簇角蚊亚属Lophoceramyia均显示为单系。基于ITS2序列所构建的MP树显示,各亚属间和种(亚种)间关系混乱。【结论】重建的分子系统发育树表明库蚊亚属不是一个单系群。在重建库蚊属系统发育关系时,相较于ITS2和COⅠ+ITS2,COⅠ是更为理想的分子标记。本研究构建的分子系统发育关系为中国库蚊属中各亚属和各种(亚种)之间的亲缘关系的研究奠定了基础。     

四种散白蚁的分子鉴定及系统发育地位(等翅目:鼻白蚁科)

【目的】目前对白蚁的物种鉴定主要依赖形态学特征,本文从分子水平对4种散白蚁进行了鉴定和系统发育分析。【方法】对4种散白蚁(湖南散白蚁Reticulitermes hunanensis Tsai et Peng、平额散白蚁Reticulitermes planifrons Li et Ping、近暗散白蚁Reticulitermes perilucifugus Ping和侏儒散白蚁Reticulitermes minuts Ping et Xu)的线粒体16Sr DNA和COⅡ基因序列进行扩增和测序,对序列进行比对及碱基组成分析后上传至GeneBank,并构建系统发育树对4种散白蚁进行系统发育分析。【结果】16S rDNA和COⅡ基因片段长度分别约380bp和720bp,两个基因的AT碱基含量均远远大于GC,16S rDNA序列的遗传距离普遍大于COⅡ序列,且两者的系统发育情况不一致。【结论】COⅡ基因系统发育与地理位置差距相关较为明显,16S rDNA基因序列碱基差异较COⅡ多,推断COⅡ基因更适合于白蚁由于地理位置引起的系统发育和地理迁徙及传入情况的研究,16S rDNA基因更适合于白蚁种类的鉴别。     

16S rRNA及rpoC1基因用于螺旋藻、节旋藻系统发育的比较北大核心CSCD

【目的】利用16S rRNA和rpoC1基因分子标记研究螺旋藻、节旋藻的系统发育关系,并对其区分能力进行比较。【方法】以84株螺旋藻、节旋藻为研究对象,对其进行16S rRNA、rpoC1基因序列的扩增、测序及分析,并对构建的系统发育树进行对比。【结果】rpoC1基因序列保守位点所占比例49.7%、平均G+C百分含量47.7%和序列相似度76%–100%明显低于16S rRNA基因序列的79.4%、55.6%和91%–100%,其变异程度高于16S rRNA基因;基于16S rRNA、rpoC1基因构建的系统发育NJ树拓扑结构基本一致,84株实验藻株分为2个属3个类群,其中仅F-351、F-904-2、F-1070和TJBC14-1藻株为螺旋藻,其余均为节旋藻;虽然2个基因都不能区分形态种和地理种,但rpoC1基因NJ树的置信度(100%)高于16S rRNA基因(99%),属内分群效果也明显优于16S rRNA基因。【结论】支持了螺旋藻、节旋藻为两个不同属的结论,且在属内分类时rpoC1基因比16S rRNA基因具有更高的区分度。     

Molecular characterization of Acidithiobacillus ferrooxidans and A. thiooxidans strains isolated from mine wastes in Brazil

Nineteen strains of Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans, including 12 strains isolated from coal, copper, gold and uranium mines in Brazil, strains isolated from similar sources in other countries and the type strains of the two species were characterized together with the type strain of A. caldus by using a combination of molecular systematic methods, namely ribotyping, BOX- and ERIC-PCR and DNA-DNA hybridization assays. Data derived from the molecular fingerprinting analyses showed that the tested strains encompassed a high degree of genetic variability. Two of the Brazilian A. ferrooxidans organisms (strains SSP and PCE) isolated from acid coal mine waste and uranium mine effluent, respectively, and A. thiooxidans strain DAMS, isolated from uranium mine effluent, were the most genetically divergent organisms. The DNA-DNA hybridization data did not support the allocation of Acidithiobacillus strain SSP to the A. ferrooxidans genomic species, as it shared only just over 40% DNA relatedness with the type strain of the species. Acidithiobacillus strain SSP was not clearly related to A. ferrooxidans in the 16S rDNA tree.     

Assessment of the genetic diversity of Xylella fastidiosa isolated from citrus in Brazil by PCR-RFLP of the 16S rDNA and 16S-23S intergenic spacer and rep-PCR fingerprinting

The genetic diversity among twenty three strains of Xylella fastidiosa, isolated from sweet orange citrus, was assessed by RFLP analysis of the 16S rDNA and 16S-23S intergenic spacer and by rep-PCR fingerprinting together with strains isolated from coffee, grapevine, plum and pear. The PCR products obtained by amplification of the 16S rDNA and 16S-23S spacer region were digested with restriction enzymes and a low level of polymorphism was detected. In rep-PCR fingerprinting, a relationship between the strains and their hosts was observed by using the BOX, ERIC and REP primers. Two major groups were obtained within the citrus cluster and relationships to the geographic origin of the strains revealed. Citrus strains isolated from the States of São Paulo and Sergipe formed one group and strains from the Southern States formed another group. Distinct origins of X. fastidiosa in the Southern and Southeastern States is postulated. The pear isolate was distantly related to all of the other X. fastidiosa strains.     

云南蔗区甘蔗线条花叶病毒分离物NIa基因形成新簇

【目的】利用NIa基因,阐明甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)的种系发生关系,为预测SCSMV流行变异趋势及科学防控提供理论依据。【方法】从云南蔗区和国家甘蔗种质资源圃采集感病样品,RT-PCR扩增获得SCSMV NIa基因序列后,使用Splits Tree、RDP、Phy ML、Dna SP等软件分析SCSMV中国分离物的系统发生、选择压力及基因流动等特征。【结果】共获得23条SCSMV NIa基因序列。这些序列间未发生重组,云南蔗区的部分序列形成1个新簇,且云南蔗区与国家甘蔗种质资源圃之间的基因交流不显著。此外,选择压力分析表明,NIa基因受很强的负选择压力作用。【结论】与P1、HC-Pro和CP等基因类似,SCSMV在NIa基因上也包含5个簇;SCSMV云南分离物具有较高的遗传多样性和清晰的地理相关性。     

四川甘孜州高山葡萄酒产区酵母菌多样性分析

【背景】西南高山葡萄酒产区的甘孜州产区,具有生产优质葡萄酒的自然禀赋。【目的】研究四川甘孜州葡萄酒产区真核微生物种类多样性、本土酿酒酵母遗传多样性,以及商业酵母对本土酵母多样性的影响。【方法】利用ITS高通量测序技术对赤霞珠接种发酵和自然发酵过程中的微生物进行多样性分析,并利用Interdelta指纹图谱分析法,对经过26S rRNA基因鉴定的野生酿酒酵母基因型进行分类。【结果】ITS测序结果显示,接种发酵和自然发酵各时期均注释到7个科7个属的酵母,通过Interdelta指纹图谱分析发现甘孜州产区的酿酒酵母共有5种基因型。该产区酿酒酵母的6株代表菌株与我国其他产区109株酿酒酵母的进化树分析结果显示,均与来自北京产区的酿酒酵母菌株亲缘关系更近。【结论】甘孜州葡萄酒子产区酵母资源丰富,表现出较高的微生物多样性和中等程度的本土酿酒酵母基因型多样性,为后续优良本土酵母菌株的筛选奠定基础。     

造礁石珊瑚共生虫黄藻离体培养方法的优化

【目的】开发一种高效地从造礁石珊瑚中分离、培养共生虫黄藻的技术方法,为珊瑚共生虫黄藻藻种资源储备和生理功能研究积累基础。【方法】首先采用微孔滤网过滤法和密度梯度离心法从造礁石珊瑚组织中直接分离或富集共生虫黄藻细胞,然后用改良的L1培养基在96孔板上对所得细胞进行离体培养,最后进行单细胞分离、培养和(或)平板划线培养获得单克隆虫黄藻细胞系。对所得虫黄藻单克隆藻株进行聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性(polymerase chainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)分析,结合内转录间隔区2(internal transcribed spacer2,ITS2)和大亚基(large subunit,LSU)测序进行物种鉴定及系统发育分析。【结果】采用上述方法从涠洲岛的霜鹿角珊瑚(Acropora pruinose)和西沙群岛的丛生盔形珊瑚(Galaxea fascicularis)及柔枝鹿角珊瑚(Acropora tenuis)中分离、培养得到3个虫黄藻株系,编号分别为AP21C1、GF21D1和AT21A...     

基于多位点序列分型对新疆伊宁学龄儿童肠道两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)群体遗传差异解析

【背景】两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)是专性代谢人体母乳寡糖(human milk oligosaccharides, HMOs)和宿主肠道黏膜上皮黏蛋白聚糖的肠道共栖益生菌,对生命早期健康和发育至关重要,目前对其不同人群来源的群体遗传报道较少。【目的】探究在有限地域内遗传、饮食相近人群来源的B. bifidum菌株集的遗传结构是否具有族群特异的规律性,为开发个性化的益生菌株提供理论基础。【方法】对来自新疆伊宁两个族群(维吾尔族和哈萨克族)学龄儿童队列的肠道两歧双歧杆菌进行分离和鉴定,共获得115个菌株,对基于细菌基因组重复序列PCR (repetitive sequence-PCR, rep-PCR)方法筛选的53株代表菌株采用多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)进行群体遗传差异分析。【结果】53株代表菌株共分为37个序列型(sequence type, ST),具有很高的遗传多样性;其中26株源自维吾尔族儿童的菌株有17个ST,而20个ST来自27株哈萨克族儿童的菌株,两个族群来源的菌株之间检测到较少的同源基因重组事件。goeBURST分析显示,来自同一族群的B. bifidum分离株比来自另一族群的菌株更有可能被归入特定的系统发育分支或克隆复合体(clonal complexes, CC)。【结论】不同族群来源的B. bifidum分离株显示出较高的遗传多样性,群体遗传结构一定程度上呈现出民族族群来源的特异性,需要更大规模的取样证实。这为进一步开展体内外实验并筛选针对区域族群的特色优良益生菌株提供了理论基础。     

托光柄菇属一中国新记录种

[背景] 托光柄菇属（Volvopluteus）隶属于光柄菇科（Pluteaceae）,目前世界上仅有4个种。[目的] 调查我国东北地区大型真菌资源。[方法] 采集大型真菌标本,对其形态进行详细的观察和描述,提取DNA,测定rDNA ITS序列,基于最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树。[结果] 2019–2020年在吉林省延边朝鲜族自治州敦化市采集的标本中,有6份标本为密执安托光柄菇V.michiganensis,该种真菌此前未在我国发现。在系统发育分析中,采自我国的密执安托光柄菇V.michiganensis与该种的模式标本聚为一个分支。[结论] 密执安托光柄菇V.michiganensis为中国新记录种。