金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究

以Sepharose CL-6B为载体,环氧氯丙烷为活化剂,羧甲基天冬氨酸（CM-Asp）为螯合配基制备载有Co2+的金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose,并将其用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究。对纯化200 μL细胞裂解液中靶蛋白所需Co-CM-Asp-Sepharose介质用量,Co-CM-Asp-Sepharose与细胞裂解液的孵育时间,介质清洗条件及靶蛋白洗脱时所需咪唑浓度等进行了优化。比较了Co-CM-Asp-Sepharose与Ni-NTA-Agarose(Qiagen公司)两种螯合介质对融合蛋白的纯化效果,开展了从5mL细胞裂解液中放大规模纯化融合蛋白的研究,并通过Bradford法测定了Co-CM-Asp-Sepharose对CD155D1蛋白的纯化量。结果表明：对200μL细胞裂解液纯化体系, Co-CM-Asp-Sepharose（50%悬浮液）的优选体积为60μL,最佳孵育时间为30min,洗脱液最佳咪唑浓度为200mmol/L,纯化得到融合蛋白的量约为200μg。介质用量放大为1.5mL（50%悬浮液）对CD155D1蛋白的纯化量可达4.6mg。与商品化Ni-NTA-Agarose相比,本介质具有选择性好,清洗条件简单,得到的靶蛋白纯度高等优点。     

金属螯合亲和层析纯化金属硫蛋白

将二价铜离子螯合在Chelating Sepharose Fast Flow凝胶上制成亲和层析柱,锌诱导兔肝和镉诱导小鼠肝经匀浆、乙醇处理后上柱,用pH4.0的醋酸盐缓冲液平衡,再用pH5.2不同浓度的醋酸盐缓冲液分别洗脱,可得两个金属硫蛋白(MT)洗脱峰,经确定先后为MT-2和MT-1.分离方法比传统的凝胶过滤-离子交换法简单、省时,适于实验室规模分离纯化.     

铜离子螯合亲和层析纯化人铜锌超氧化物歧化酶

用铜离子螯合亲和层析对人红细胞铜锌超氧化物歧化酶进行了纯化．3次实验的结果表明,此项层析具有重复使用率高和蛋白结合量大的显著优点．提纯的人铜锌超氧化物歧化酶的比活性为3037U每毫克蛋白,并经活性染色和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其纯度均一．纯化中,探索了用紫外260nm与280nm的A比值判断酶纯度的简便方法．     

金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究

金属螯合亲和层析是近20年发展起来的一项新型分离技术。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。本文从单组分蛋白质入手,考查了pH值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响,并进行了分析。还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究,比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别,为实际体系的分离研究打下了基础。     

重组人Fab金属螯合层析法纯化条件的研究

在重组人Fab(rh Fab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸, 使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附, 可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化. 采用自制金属(铜、锌金属离子)螯合层析介质, 以pH和咪唑两种洗脱方法,对rh Fab段的纯化效果进行了探讨. 结果显示: 铜离子螯合层析介质比锌离子螯合层析介质对rh Fab的亲和能力更强; pH洗脱方法的重复性优于咪唑法; 金属铜离子螯合层析法对rh Fab进行一步纯化可得到纯度大于95%的rh Fab产品.     

多聚组氨酸融合标签在蛋白药物开发中的应用

纯化技术是制约蛋白质药物开发及其产业化的关键技术之一。构建多聚组氨酸标签融合蛋白,采用固定金属离子亲和层析进行纯化,是一种高效的蛋白质纯化策略。介绍多聚组氨酸融合标签在蛋白质药物开发中的应用基础和应用概况,分析多聚组氨酸标签在融合蛋白中的位置对亲和层析纯化的影响,总结常用的多聚组氨酸融合表达方式,并对其融合表达样品的预处理、亲和层析纯化条件及其对目的蛋白药物药用安全性和有效性的影响进行探讨。     

金属硫蛋白融合蛋白的分离纯化

采用IPTG诱导新1#菌BL21（DE3）（pET21a-MT)高效表达Balb/C小鼠金属硫蛋白融合蛋白,并采用包涵体分离纯化方法及Sephadex G-75柱层析得到SDS－PAGE电泳为一条带的金属硫蛋白融合蛋白收集液。     

一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法

用马铃薯淀粉柱可以直接分离麦芽糖结合蛋白-乳酸脱氢酶辅酶结合结构域融合蛋白,并得到满意的结果.它提纯的程度和吸附量都和商品交联直链淀粉亲和层析柱相比拟,但是成本却要低很多,而且从市场上买来的马铃薯淀粉就可以应用.它可以成为大规模生产的一种工艺路线.     

金属螯合亲和层析法纯化猪红细胞超氧化物歧化酶

本文报道以Sephadex G-200为基质的金属螯合亲和层析法纯化SOD、其比活为4508U/mg蛋白,收率为90.4％,经酸、碱、SDS-PAGE、考马斯亮兰染色均呈一条带,特异性的SOD活性染色呈阳性。分子量为34,000,氨基酸组成测定表明Tyr含量少,Gly含量高,紫外吸收光谱最大吸收在258nm处,园二色谱结果表明SOD空间结构为β—折迭及无规态,含极少量或几乎不含α—螺旋,等电聚焦电泳测定SOD有微不均一性,等电点分别为5.25,5.35和5.65。     

金属螯合亲和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶

将重组人铜锌超氧化物歧化酶（rhCu,ZnSOD）包含体（经纯化后纯度达80％以上）以稀释法或透析法初步复性后,分别再经金属螯合亲和层析（MCAC）纯化。结果透析复性样品和稀释复性样品经MCAC纯化后的rhSOD比活是各自上柱前样品比活的2.2倍和5.3倍,蛋白回收率分别为64％和25％,同时两者活性回收率皆大于130％。表明目标蛋白rhSOD在经过MCAC纯化的同时又获得进一步复性。SDS-PAGE显示rhSOD为19kD的单一条带,纯度大于95％,比活达到5000 u/mg左右,同时NBT生物活性染色鉴定显示出很强的超氧化物歧化酶活性。表明MCAC对于复性不完全的rhCu,ZnSOD而言是一种纯化和使其进一步复性的简便省时且有效的方法。该方法为以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化和复性提供了新思路。     

金属螯合亲和层析的应用研究进展

金属螯合亲和层析是近30年来出现的一种新型的分离纯化技术,它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一.其在蛋白质、酶和核苷酸纯化以及蛋白质分析等方面具有广泛的应用.而随着研究的进一步深入,其新应用也越来越广泛的被发现.     

用琼脂糖亲和层析一步纯化蓖麻毒蛋白

本文报道了一种单用琼脂糖(Sepharose4B)来纯化蓖麻毒蛋白的快速简便的方法。我们发现在pH5的条件下,蓖麻毒蛋白和与其密切相关的蓖麻凝集素对琼脂糖的结合能力有很大的差别。在有0.2mol/LD-半乳糖存在下可将蓖麻毒蛋白从Sepharose上洗下,同样条件下蓖麻凝集素仍牢固地结合在柱上。从而经一步柱层析便可得到电泳纯的蓖麻毒蛋白。此法不需另行合成亲和胶,适合于蓖麻毒蛋白的大规模纯化。     

一种制备GST融合蛋白亲和层析胶的方法

谷胱甘肽Ｓ 转移酶 (ＧＳＴ)融合蛋白表达系统是将外源基因与ＧＳＴ基因融合后在细菌内表达的原核表达系统 .这个系统使外源基因的转录和翻译效率提高 ,同时 ,也避免了外源蛋白受细菌本身蛋白酶的降解 ,从而实现高效表达 .己成为一项常规的实验室操作 ,在大规模工业生产中也广泛应用 .然而 ,该系统采用的亲和层析固定相是商品化的谷胱甘肽琼脂糖 ,价格昂贵 ,限制了这一系统的应用 .我们提供了一种制备谷胱甘肽琼脂糖的方法 ,以获得ＧＳＴ亲和层析胶 ,用于纯化谷胱甘肽转移酶和ＧＳＴ融合蛋白 ,这种方法简单、经济、效果也好 ,现介绍如下 :取…     

金属螯合亲和层析法纯化抗乙肝核心抗原单克隆抗体

采用金属螯合亲和层析法,纯化了小鼠腹水来源的抗乙肝核心抗原单克隆抗体,对上样缓冲液的pH和离子强度、洗脱液种类和洗脱方式进行优化。结果表明,采用降低pH分步洗脱时,最佳上样缓冲液为pH8.0,20mmol/LPB+0.5mol/LNaCl,抗体在pH5.0被洗脱下来,抗体回收率80%,纯度85%。采用咪唑浓度梯度洗脱时,最佳的上样缓冲液为pH8.0,20mmol/LPB+5mmol/L咪唑,抗体纯度大于95%,回收率65%;在上样缓冲液中不添加NaCl而添加少量的咪唑,更有利于抗体分离。以上洗脱方式都能较好地保持mAb的生物学活性,为该抗体的应用提供了必要的实验基础。     

OSBP的PH结构域的融合表达纯化及其二级结构的初步分析

氧类固醇结合蛋白（OSBP）是胆固醇类代谢过程的调节物。为了进一步研究OSBP的功能以及结构与功能之间的关系,将OSBP PH－pRSET-A的质粒转化入E.coli JM109（DE3）,并在无机培养基中获得高效可溶表达。表达的蛋白质经Ni^2 -NTA偶联的琼脂糖珠纯化,通过圆二色性分析纯化的蛋白质的二级结构,结果为：α螺旋占7.2%,β折叠占71.1%,无规则卷曲占21.7%。     

雪松聚球藻金属硫蛋白的纯化及其性质的研究

在雪松聚球藻的培养基中逐渐增加氯化镉的浓度以诱导藻细胞内金属硫蛋白的合成,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０,ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５柱层析,获得的ＭＴ没有亚型,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析是高度均一的。每个蛋白分子约含５个Ｃｄ原子,１０个巯基,分子量约为７．６ＫＤ,等电位ｐＨ４．５左右,半胱氨酸含量约占总氨基酸量的１５．５％,还含有少量的芳香族氨基酸,ＭＴ的最大紫外吸收在２５     

聚球藻类金属硫蛋白的纯化及部分性质的研究

单细胞蓝藻以５０μｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ＾２＋诱导８ｄ后收集,破碎取上清液经凝胶过滤,离子交换层主反相ＨＰＬＣ纯化得到类金属硫蛋白,产率为每升培养液收集１．５ｇ鲜藻,得２．５ｍｇ纯品。其单体分子量为８７５０,Ｎ末端测定为缬氨酸,氨基酸组成分析得每分子含１０个半胱氨酸,疏水氨酸较多,且含有芳香族氨基酸,原子吸收光谱测得每分子蛋白结合４个二价金属。     

重组人Fab金属螯合金层析法纯化条件的研究

在重组人Ｆａｂ表达载体的羧基端插入六个组氨酸,使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附,可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化。采用自制金属螯合层析介质,以ＰＨ和咪唑两种脱方法,对ｒｈＦａｂ段的纯效果进行了探讨。     

金属螫合亲和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶

将重组人铜锌超氧化物歧化酶（rhCu,Zn-SOD）包含体（经纯化后纯度达80％以上）以稀释法或透析法初步复性后,分别再经金属螯合亲和层析（MCAC）纯化。结果透析复性样品和稀释复性样品经MCAC纯化后的rhSOD比活是各自上柱前样品比活的2．2倍和5．3倍,蛋白回收率分别为64％和25％,同时两者活性回收率皆大于130％。表明目标蛋白rhSOD在经过MCAC纯化的同时又获得进一步复性。SDS-PAGE显示rhSOD为19kD的单一条带,纯度大于95％,比活达到5000u／mg左右,同时NBT生物活性染色鉴定显示出很强的超氧化物歧化酶活性。表明MCAC对于复性不完全的rhCu,Zn-SOD而言是一种纯化和使其进一步复性的简便省时且有效的方法。该方法为以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化和复性提供了新思路。     

金属螯合肽分离纯化及其抗氧化活性的研究进展

综述了金属螯合肽的来源、分离纯化及构效关系,分析了金属螯合肽抗氧化活性的相关研究进展,并展望了金属螯合肽的发展前景。