在活体小鼠中筛选lZP3基因RNAi有效靶位点的研究

ZP3作为精子结合的靶对象在卵母细胞受精中起着关键作用,也因此而成为研究哺乳动物受精机理的焦点。本研究参照新疆草原兔尾鼠卵透明带3(zonapellucida3geneofLaguruslagurus,lZP3)的mRNA,选择了针对lZP3mRNA的3个区域合成寡聚核苷酸连接到干扰载体pGenesil-1上,构建了3个针对lZP3mRNA的重组干扰载体,和pCDNA3-lZP3表达载体采用脂质体法共转染Hela细胞以及通过尾静脉大容量快速注射法(Hydrodynamics-basedtransfectionmethod,HD法)共注射小鼠,半定量RT-PCR和real-timePCR检测Hela细胞和小鼠肝脏中lZP3mRNA的表达情况,以筛选干扰lZP3mRNA的有效靶位点。结果表明,通过HD法共注射干扰载体和表达载体后,外源基因mRNA在小鼠肝脏中的表达和共转染Hela细胞后在Hela细胞中的表达情况是一致的,有2个干扰载体可以有效干扰lZP3mRNA的表达。研究还说明,利用HD法以小鼠作为实验材料筛选RNA干扰的有效靶位点是一条切实可行的方法。     

肠道病毒71型基因组中小干扰RNA的靶位点预测

肠道病毒71型（EV71）已经在世界范围内有过十多次大的爆发与流行,近年来EV71病毒的流行在亚洲逐渐呈上升的趋势,但是目前尚无有效的治疗措施,因此迫切需要一种治疗EV71的有效药物。本文采用生物信息学的方法,对人类EV71病毒三个不同株型（SHZH03,SHZH98和MS）RNA序列的局域二级结构进行了预测,并从这些病毒株的基因组中分别得到了长度在21～25nt的小干扰RNA靶序列碱基片段。这一结果将有助于治疗EV71药物的开发研究,对预防和控制EV71的爆发和流行也会有重要意义。     

小鼠Biccl基因RNAi序列的筛选与鉴定

通过网上提供的生物信息学分析软件进行搜索和比对,初步筛选到3个较好的针对小鼠双尾-C（Bicc1）基因的RNA干扰（RNAi）序列。合成这三个干涉序列片段后克隆到pRS-Hush shRNA载体中。构建Bicc1基因的真核表达载体pEGFP-C3-Bicc1,将绿色荧光蛋白(GFP)标签标记在Bicc1蛋白上。利用细胞转染技术将pEGFP-C3-Bicc1与3个干涉序列载体共转染至体外培养的HEK-293细胞中,最后通过细胞荧光强度,半定量PCR和Western blotting鉴定出其中两个序列（pRS-Hush-RNAi-Bicc1-N/-C）能明显降低Bicc1蛋白在HEK-293细胞中的表达水平,为下一步建立起低表达Bicc1的稳定细胞株和研究小鼠Bicc1的功能提供了良好的材料。     

RNAi及DNA芯片分析肝癌细胞系中受DNMT3B调控的下游基因

为揭示DNA甲基转移酶3B（DNMT3B）在肝癌中是否参与了肿瘤的发生,应用Western blotting及细胞免疫化学方法分析DNMT3B蛋白在人的正常肝细胞株、肝癌癌旁细胞株及肝癌癌细胞株中的表达。构建了DNMT3B的RNAi稳定表达的重组载体,并转染人肝癌细胞株SMMC-7721中。以半定量RT-PCR及Western blotting分别鉴定DNM73B RNAi表达载体对内源性DNMT3B的抑制效率。用高通量的cDNA基因芯片分析了SMMC-7721中DNMT3B抑制后有影响的下游基因谱。结果显示,DNMT3B在肝癌细胞株中的表达水平明显高于肝癌癌旁和正常肝细胞株。DNMT3B的RNAi稳定表达重组载体转染SMMC-7721细胞株2个月后,观察到DNMT3B明显受到抑制。cDNA基因芯片分析发现,DNMT3B抑制后诱导26条基因表达下调,115条基因表达上调,包括一些发育相关基因以及肿瘤相关基因,如SNCG、NOTCH1、MBD3、WNT11、MAOA、FACL4等。提示DNMT3B的高表达可能与肝癌的发生有关,并以调控其他相关基因的表达而起作用,包括与发育相关的重要基因。     

草菇Vvrin1基因RNAi转化子的筛选及其转录组分析

草菇味道鲜美,食用价值高,是我国主要栽培的商业食用菌之一.MADS-box转录因子对真核生物的生长发育和信号传导具有关键性的调控作用.本研究通过农杆菌介导的方法获得5个草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因的RNA干扰转化子,并进一步对转化子的表型进行分析,发现5个转化子菌丝在PDA固体培养基和栽培料中的生长速度...     

parp10基因RNA干扰有效靶点的筛选及验证

目的：合成并筛选有效抑制parp10表达的siRNA。方法：根据parp10 cDNA序列,设计并合成prap10基因潜在的RNA干扰（RNAi）片段,将合成的寡核苷酸序列构建到pEGFP-C1H1U6载体中;通过双萤光素酶试验、Western blotting筛选有效的干扰序列;进一步用G418对A549细胞进行耐受度筛选,确定最低耐受度;用G418溶液对转染RNAi重组质粒的A549细胞进行筛选,通过RT-PCR鉴定干扰效果。结果：针对617bp处所构建的RNAi载体能够抑制PARP10的表达,用浓度为400μg/mL G418的McCoy′s 5A培养基筛选转染后的细胞,获得了能够表达绿色荧光标签蛋白的A549细胞株,经RT-PCR检测发现,PARP10表达受到抑制。结论：获得了能够有效抑制PARP10表达的特异性小干扰RNA（siRNA）,为进一步研究其生物学功能提供了条件。     

RNAi沉默STAT3基因对人大细胞肺癌细胞增殖的影响

旨在研究RNAi沉默STAT3基因对人大细胞肺癌NCI-H460细胞增殖的影响。针对STAT3基因mRNA设计合成5条短发夹DNA,构建重组SiRNA-ST3质粒(命名为SiRNA-ST3-1,2,3,4,N)。用重组质粒分别转染NCI-H460细胞,RT-PCR法检测转染24 h后STAT3 mRNA的表达;Western blotting法检测转染24 h和48 h后STAT3、pSTAT3蛋白表达;MTT法检测转染24 h、48 h、72 h后NCI-H460细胞增殖情况。结果显示,SiRNA-ST3载体构建成功。RT-PCR和Western blotting检测结果表明,NCI-H460细胞转染重组质粒SiRNA-ST3-2和SiRNA-ST3-3后STAT3基因mRNA转录和STAT3、pSTAT3蛋白表达都明显下降(P<0.05)。与未转染组比,SiRNA-ST3-2组和SiRNA-ST3-3组NCI-H460增殖能力24 h、48 h降低明显(P<0.05);与SiRNA-ST3-N组比,SiRNA-ST3-2组和SiRNA-ST3-3组NCI-H460增殖能力48 h降低明显(P<0.05)。由此证实,构建的重组质粒SiRNA-ST3-2、SiRNA-ST3-3能有效靶向沉默STAT3基因,并抑制人大细胞肺癌NCI-H460细胞的增殖能力。     

小鼠XBP1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选

目的:构建小鼠XBP1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,筛选具有较好干扰效率的小鼠XBP1 siRNA靶序列.方法:针对小鼠XBP1基因特异性序列,设计4个RNAi靶序列及1个阴性对照序列,合成含有正义和反义Oligo DNA的互补DNA序列,退火形成双链DNA,并克隆到经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定.由病毒包装系统进行包装,经滴度测定后感染NIH3T3细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的寡核苷酸链插入正确,293T细胞测定病毒滴度为1×108TU/ml.Real-timePCR证实XBP1-siRNA-3靶点的干扰效率最高,其干扰效率达到95%以上.结论:成功构建并筛选了小鼠XBP1基因RNAi慢病毒载体,为研究XBP1在巨噬细胞免疫功能调控中的作用奠定了基础.     

细菌介导的RNA干扰对C.elegans中par-3基因的作用

设计并构建了针对par-3基因的发夹RNA载体,将构建好的质粒转入大肠杆菌HT115,25℃喂食Caenorhabditis elegans（C.elegans）野生型虫体,24h后观察par-3（RNA干扰）celegans的胚胎发育情况。结果显示通过喂食形成发夹结构dsRNA的细菌可以对celegans中par-3基因进行RNA干扰,干扰率可以达到60％以上。干扰后的早期胚胎发育丧失第一次卵裂的不对称性,第二次卵裂的纺锤体方向发生改变,与par-3突变体的观察结果一致,为进一步在mex-3转基因虫体中通过RNA干扰研究基因表达打下了基础。     

RNAi在害虫防治中应用的重要进展及存在问题

RNAi是目前最有可能应用于害虫绿色防控的新技术。2017年6月,美国环境署(EPA)批准了国际上第一例表达昆虫双链RNA(dsRNA)的抗虫转基因玉米MON87411,掀起了利用RNAi技术进行害虫防治研究新的热潮。但是,目前RNAi在害虫防治中的应用还存在一些问题,例如有效靶标基因筛选和应用策略,鳞翅目昆虫对RNAi的敏感性以及双链RNA在环境中的稳定性等等。本文系统总结了RNA干扰现象发现20年来,该技术在害虫防治领域的研究及应用概况,并对RNAi技术应用的可行性、应用方法、存在问题和目前的一些解决办法进行了比较详细的综述。通过对近期研究结果的综合分析发现,dsRNA进入某些鳞翅目昆虫中肠或血淋巴后,被相关核酸酶降解可能是其RNAi效率较低的首要原因。通过对dsRNA进行脂质体修饰,纳米粒子包埋可以在一定程度上解决dsRNA降解的问题,进而提高RNAi效率。     

水压转染法在小鼠不同肝叶的表达效率

为了解水压转染法(hydrodynamics-based transfection,HDT)在小鼠肝脏不同肝叶的转染效率,将容量为小鼠体重的10%,绿色荧光蛋白基因质粒pEGFP-C1含量为35μg/只的生理盐水溶液以0.4 mL/s的速度从小鼠尾静脉注射,于注射后不同时间取小鼠各肝叶制备冰冻切片,在荧光显微镜下观察,计数各肝叶的绿色荧光蛋白表达情况。结果显示注射后12 h,绿色荧光蛋白阳性细胞比例最高,从24 h起表达量逐渐减少,至48 h时各肝叶均基本难以检测出绿色荧光蛋白阳性细胞。在12 h观察各肝叶的转染效率如下:右叶、蒂状叶的绿色荧光蛋白阳性细胞约为22%,左叶、中叶、尾状叶约为15%取材部位不同会造成数据分析的极显著差异。     

RNA干扰抑制人乙型肝炎病毒复制的研究

采用表达shRNA的载体构建了表达针对病毒HBsAgmRNA保守区的shRNA的质粒psiHBs,利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价RNA干扰对HBV复制和基因表达的抑制作用。通过Western印迹检测细胞内的HBsAg,用ELISA检测细胞培养上清和血清中的HBsAg,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,最后通过免疫组化的方法检测肝组织切片中HBcAg的表达情况。结果显示pHBV1.3和psiHBs共转染HepG2后,与对照组相比病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平下降了90%以上,并且shRNA的作用效率存在序列特异性和剂量依赖性。在高压注射小鼠模型中,psiHBs表达的shRNA使小鼠血清中HBsAg的水平下降了80%以上,免疫组化检测显示,小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了75.1%,而且shRNA的抑制作用至少能持续4d。研究显示载体表达的shRNA无论是在细胞或是在小鼠模型中都能对HBV的复制和基因的表达发挥序列特异性的抑制作用。本研究为我们下一步实现由RNAi介导的基因治疗提供了理论和技术支持。     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制乳腺癌细胞BSP基因表达

目的构建抑制人日5P基因表达的RNA干扰逆转录病毒载体,筛选建立稳定抑制BSP表达的MDA-MB-231BO细胞系。方法构建靶向人BSP基因的逆转录病毒重组质粒pSilencer—BSP27、pSilencer—BSP81和pSilencer—BSP100。将其包装成病毒后感染MDA—MB-23180细胞。用RT—PCR和Western印迹检测成功感染细胞（231BO．BSP27、231BO．BSP81、231BO—BSP100细胞）BSP基因的抑制效果。结果双酶切和测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同。RT—PCR和Western印迹结果显示231BO—BSP27、BO—BSP81和231BO—BSP100细胞BSP基因在mRNA水平和蛋白水平抑制效率分别为：70．8％、79．4％和30．1％：69．3％,75．2％和27．8％。结论成功构建抑制人BSP基因表达的RNAi逆转录病毒载体pSilencer．BSP27、pSilencer．BSP81和pSilencer—BSP100。获得高效稳定抑制BSP表达的231BO—BSP27、231BO．BSP81细胞系。     

通过RNA干涉沉默SARS病毒的研究前景

RNA干涉(RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默作用的重要机制之一。RNAi在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中具有广阔应用前景。本综述了RNAi在抗SARS病毒药物研究中的应用前景。     

Silencing of vanilloid receptor TRPV1 by RNAi reduces neuropathic and visceral pain in vivo

RNA interference (RNAi) has proven to be a powerful technique to study the function of genes by producing knock-down phenotypes. Here, we report that intrathecal injection of an siRNA against the transient receptor potential vanilloid receptor 1 (TRPV1) reduced cold allodynia of mononeuropathic rats by more than 50% over a time period of approximately 5 days. A second siRNA targeted to a different region of the TRPV1 gene was employed and confirmed the analgesic action of a TRPV1 knock-down. Furthermore, siRNA treatment diminished spontaneous visceral pain behavior induced by capsaicin application to the rectum of mice. The analgesic effect of siRNA-mediated knockdown of TRPV1 in the visceral pain model was comparable to that of the low-molecular weight receptor antagonist BCTC. Our data demonstrate that TRPV1 antagonists, including TRPV1 siRNAs, have potential in the treatment of both, neuropathic and visceral pain.     

Limitations of RNAi of α6 nicotinic acetylcholine receptor subunits for assessing the in vivo sensitivity to spinosad

Abstract Spinosad is a widely used insecticide that exerts its toxic effect primarily through interactions with the nicotinic acetylcholine receptor. The α6 nicotinic acetylcholine receptor subunit is involved in spinosad toxicity as demonstrated by the high levels of resistance observed in strains lacking α6. RNAi was performed against the Dα6 nicotinic acetylcholine receptor subunit in Drosophila melanogaster using the Gal4‐UAS system to examine if RNAi would yield results similar to those of Dα6 null mutants. These Dα6‐deficient flies were subject to spinosad contact bioassays to evaluate the role of the Dα6 nicotinic acetylcholine receptor subunit on spinosad sensitivity. The expression of Dα6 was reduced 60%–75% as verified by quantitative polymerase chain reaction. However, there was no change in spinosad sensitivity in D. melanogaster. We repeated RNAi experiments in Tribolium castaneum using injection of dsRNA for Tcasα6. RNAi of Tcasα6 did not result in changes in spinosad sensitivity, similar to results obtained with D. melanogaster. The lack of change in spinosad sensitivity in both D. melanogaster and T. castaneum using two routes of dsRNA administration shows that RNAi may not provide adequate conditions to study the role of nicotinic acetylcholine receptor subunits on insecticide sensitivity due to the inability to completely eliminate expression of the α6 subunit in both species. Potential causes for the lack of change in spinosad sensitivity are discussed.     

RNA干扰抑制SiHaB2细胞中Bcl-2基因的表达

Bcl-2基因作为细胞凋亡的一个潜在抑制剂调节细胞的死亡,抑制恶性肿瘤细胞中Bcl-2基因的表达可促进肿瘤细胞的凋亡。采用RNA干扰技术,合成了含有21个核苷酸的小双链干扰RNA（siRNA．Bcl-2）,并构建了含有19个核苷酸基因的质粒载体（pSilencer2．1-U6-Bcl-2）,把合成的siRNA．Bcl-2和pSilencer2．1-U．Bcl-2分别转导入Bcl-2高表达的细胞株SiHaB2中,通过Western印迹检测,免疫荧光法检测及DNA梯（ladder）检测,可观察到在导入siRNA．Bcl-2和pSilencer2．1-U．Bcl-2的SiHaB2细胞被培养72h后,可以明显抑制Bcl-2蛋白的表达。