siRNA抑制S100A4表达对卵巢癌细胞CP70生物学特性的影响

目的：探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70沉默S100A4基因后,CP70细胞对顺铂敏感性、凋亡及细胞迁移的影响。方法：设计并合成S100A4基因特异性的siRNA并转染入卵巢癌细胞CP70,48 h后应用RT-PCR和Western Blot检测在mRNA和蛋白水平siRNA对S100A4的影响,MTT法检测转染siRNA后卵巢癌细胞CP70对顺铂敏感性的变化。用流式细胞术检测顺铂（40μM）对转染S100A4 siRNA后对卵巢癌细胞CP70凋亡的影响,Transwell法观察siRNA抑制S100A4后对卵巢癌CP70迁移能力的影响。结果：与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4siRNA转染组CP70细胞的S100A4基因和蛋白表达降低（P〈0.01）。MTT法检测顺铂敏感性发现S100A4 siRNA转染组CP70细胞顺铂敏感性增强。在顺铂刺激下,siRNA转染组细胞凋亡率高于其他各组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。Transwell发现CP70细胞迁移能力明显下降（P〈0.05）。结论：S100A4 siRNA能够明显抑制CP70细胞S100A4的表达,从而增强细胞对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡,减弱细胞的迁移能力。S100A4有望成为逆转卵巢癌铂类耐药的治疗靶点。     

siRNA抑制S100A4 表达对卵巢癌细胞CP70生物学特性的影响

摘要 目的：探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70沉默S100A4 基因后,CP70细胞对顺铂敏感性、凋亡及细胞迁移的影响。方法：设计并合成S100A4基因特异性的siRNA并转染入卵巢癌细胞CP70,48 h后应用RT-PCR和Western Blot检测在mRNA和蛋白水平siRNA对S100A4的影响,MTT法检测转染 siRNA后卵巢癌细胞CP70对顺铂敏感性的变化。;用流式细胞术检测顺铂（40 μM） 对转染S100A4 siRNA后对卵巢癌细胞CP70凋亡的影响,Transwell法观察siRNA抑制S100A4后对卵巢癌CP70迁移能力的影响。 结果：与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4 siRNA转染组CP70细胞的S100A4基因和蛋白表达降低(P<0.01)。MTT法检测顺铂敏感性发现S100A4 siRNA转染组CP70细胞顺铂敏感性增强。在顺铂刺激下,siRNA转染组细胞凋亡率高于其他各组,差异具有统计学意义（P<0.05）。Transwell发现CP70细胞迁移能力明显下降（P<0.05）。结论：S100A4 siRNA能够明显抑制CP70细胞S100A4的表达,从而增强细胞对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡,减弱细胞的迁移能力。S100A4有望成为逆转卵巢癌铂类耐药的治疗靶点。     

靶向抑制铜伴侣蛋白CCS逆转卵巢癌C13*细胞的顺铂耐药性

顺铂（cisplatin）,即二胺二氯铂/diaminedichloroplatinum（DDP）,是治疗卵巢癌最有效的化疗药物;然而,耐药性是限制顺铂临床治疗效果的最重要因素。目前,卵巢癌对顺铂的耐药机制仍不十分清楚。超氧化物歧化酶1铜伴侣蛋白（copper chaperone for superoxide dismutase 1, CCS）介导Cu2+特异性传递给超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1, SOD1）,为维持细胞增殖和生存所必需;相反,抑制CCS可减缓肿瘤细胞增殖。本研究旨在证明,AMPK依赖的CCS表达与卵巢癌的顺铂耐药有关。实时定量PCR及免疫印迹结果显示,与顺铂敏感细胞株OV2008比较,顺铂耐药细胞株C13*中的CCS mRNA和蛋白质表达水平明显上调。shRNA靶向沉默CCS或采用抑制剂DC_AC50抑制CCS后,可明显增强顺铂对C13*细胞增殖的抑制作用,提示CCS高表达与顺铂耐药相关,而抑制CCS可逆转顺铂的耐药性。同样,免疫印迹结果证明,CCS在A549、H1944等6种不同肺癌细胞中的表达水平高低与顺铂敏感性密切相关。采用siRNA干扰CCS在A549细胞中的高表达,或在CCS低表达的H1944细胞中过表达CCS,可明显增加A549或减弱H1944细胞对顺铂的敏感性,进一步证明CCS表达与顺铂耐药性相关。此外,采用AMPK抑制剂化合物C阻断AMPKα Thr172磷酸化（激活）,即抑制AMPK信号通路,可明显抑制CCS在C13*细胞中的表达,提高其对顺铂的敏感性。以上研究结果提示,AMPK信号通路依赖的CCS表达参与肿瘤的顺铂耐药机制,而抑制CCS逆转顺铂耐药。本文的结果还提示,CCS有望成为克服顺铂耐药的潜在靶点。     

上调hMLH1基因表达对卵巢癌药物敏感性的影响

构建携带错配修复基因hMLH1编码序列全长的真核表达质粒pCAN—hMLHl,并探讨其对卵巢癌细胞顺铂耐药的逆转作用。应用基因重组技术将pET28-hMLHl中的目的基因hMLHl定向克隆到真核表达载体pCAN,经酶切及测序鉴定：分别将pCAN—hMLHl和空质粒pCAN转染进卵巢癌耐药细胞SKOV3／DDP,同时以对顺铂敏感的sKOV3细胞和未转染的SKOV3／DDP细胞作为对照：应用RT-PCR和Westemblo凇测转染前后细胞内hMLHlmRNA和蛋白的表达变4Jc;四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测转染前后sKOv3／DDP细胞对顺铂敏感性的变化;Hoechst染色检测转染前后细胞的凋亡。结果提示：pCAN—hMLHl重组质粒经酶切及测序鉴定,表明真核表达质粒构建正确;采用脂质体法转染sKOv3／DDP细胞后,RT-PCR和Westernblot检测到耐药细胞内hMLHl的表达增强：MTT结果显示转染重组质粒后sKOv3／DDP细胞对顺铂的敏感性显著增加;Hoechst染色观察到转染后耐药细胞的凋亡明显增强。该研究成功构建了pCAN．hMLHl重组质粒,在sKOV3／DDP细胞中进行表达,并能增强耐药细胞对顺铂的敏感性,促进耐药细胞的凋亡。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α逆转肺癌细胞耐药性

目的：观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对肺癌细胞耐药性的影响。方法：构建靶向HIF-1α小干扰RNA基因,并转染到人肺腺癌耐顺铂细胞株A549／DDP细胞中。逆转录聚合酶链反应RT—PCR）检测细胞的HIF-1α、多药耐药基因-（MDR-1）以多药耐药相关蛋白基因（MRP）mRNA变化,免疫细胞化学法观察干扰后HIF-1α、P-糖蛋白以及MRP蛋白的变化。MTT法检测不同浓度的顺铂作用下细胞死亡率。结果：HIF-1αsiRNA组中H1F-1α、MDR—1、MRPmRNA水平显著降低（P〈0．05）。且蛋白水平也显著下降（P〈0．05）。HIF-1αsiRNA组细胞死亡率较未转染组均明显增高（P〈0．05）,转染siRNA阴性组不影响肿瘤细胞的耐药性。结论：HIF-1αsiRNA可显著降低A549／DDP细胞中H1F-1α、MDR-1、MRP表达,从而起到逆转肺腺癌A549／DDP细胞的耐药作用。     

氧化铁磁性纳米颗粒介导缺氧诱导因子1α shRNA质粒转染逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐药的实验研究

评价了氧化铁磁性纳米颗粒作为缺氧诱导因子1α shRNA (HIF-1α shRNA) 重组质粒载体进行体内体外转染的可行性及其逆转人肺腺癌耐药细胞株(A549/CDDP)顺铂耐性的效果,并初步探讨相关机制．在成功构建HIF-1α shRNA重组质粒后,分别利用氧化铁磁性纳米颗粒及脂质体介导质粒转染A549/CDDP细胞及其移植瘤裸鼠动物模型,荧光显微镜检测转染效率,RT-PCR及细胞免疫化学检测转染后A549/CDDP 细胞HIF-1α、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance 1,MRP1)、肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP) mRNA及蛋白质表达,免疫组化检测转染后A549/CDDP移植瘤HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达,MTT法检测转染HIF-1α shRNA前后A549/CDDP细胞对顺铂的耐药性,并检测转染HIF-1α shRNA后A549/CDDP细胞移植瘤的肿瘤生长指数,HE染色检测纳米颗粒转染对裸鼠肝、肾及脑的组织学毒理作用．结果显示,氧化铁磁性纳米颗粒介导转染相对效率高于脂质体介导(P < 0.01),HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞后HIF-1α、MRP1、LRP mRNA及蛋白质表达下降,逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐性82%,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞移植瘤裸鼠动物模型后,移植瘤组织中HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达下降,转染HIF-1α shRNA后抑制移植瘤的生长,且与顺铂有协同效应,纳米颗粒转染后裸鼠肝、肾及脑组织无坏死．这些结果说明,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA的体内体外转染效率高于脂质体,RNA干扰技术封闭HIF-1α基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性及其抑制瘤的生长,其作用可能与HIF-1α shRNA降低HIF-1α、MRP1及LRP表达有关,HIF-1α基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点,磁性纳米颗粒介导HIF-1α shRNA质粒转染具有一定的生物安全性．     

靶向抑制铜伴侣蛋白CCS逆转卵巢癌C13~*细胞的顺铂耐药性北大核心CSCD

顺铂(cisplatin),即二胺二氯铂/diaminedichloroplatinum(DDP),是治疗卵巢癌最有效的化疗药物;然而,耐药性是限制顺铂临床治疗效果的最重要因素。目前,卵巢癌对顺铂的耐药机制仍不十分清楚。超氧化物歧化酶1铜伴侣蛋白(copper chaperone for superoxide dismutase 1,CCS)介导Cu2+特异性传递给超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1,SOD1),为维持细胞增殖和生存所必需;相反,抑制CCS可减缓肿瘤细胞增殖。本研究旨在证明,AMPK依赖的CCS表达与卵巢癌的顺铂耐药有关。实时定量PCR及免疫印迹结果显示,与顺铂敏感细胞株OV2008比较,顺铂耐药细胞株C13*中的CCS mRNA和蛋白质表达水平明显上调。shRNA靶向沉默CCS或采用抑制剂DC_AC50抑制CCS后,可明显增强顺铂对C13*细胞增殖的抑制作用,提示CCS高表达与顺铂耐药相关,而抑制CCS可逆转顺铂的耐药性。同样,免疫印迹结果证明,CCS在A549、H1944等6种不同肺癌细胞中的表达水平高低与顺铂敏感性密切相关。采用siRNA干扰CCS在A549细胞中的高表达,或在CCS低表达的H1944细胞中过表达CCS,可明显增加A549或减弱H1944细胞对顺铂的敏感性,进一步证明CCS表达与顺铂耐药性相关。此外,采用AMPK抑制剂化合物C阻断AMPKα-Thr172磷酸化(激活),即抑制AMPK信号通路,可明显抑制CCS在C13*细胞中的表达,提高其对顺铂的敏感性。以上研究结果提示,AMPK信号通路依赖的CCS表达参与肿瘤的顺铂耐药机制,而抑制CCS逆转顺铂耐药。本文的结果还提示,CCS有望成为克服顺铂耐药的潜在靶点。     

shRNA沉默卵巢癌细胞SKOV-3的IDO基因表达在体外对NK细胞杀伤作用敏感性的影响

目的通过shRNA沉默吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine2,3-dioxygenase,IDO）基因表达,研究IDO表达在体外对NK细胞杀伤能力的作用。方法 shRNA沉默IDO基因表达质粒和空白质粒分别稳定转染至人卵巢癌细胞SKOV-3,应用Western blot检测IDO在SKOV-3、SKOV-3/Mock和SKOV-3/shIDO细胞中的表达情况,用MTT试剂盒检测3组肿瘤细胞体外生长速度和对NK细胞杀伤作用的敏感性。结果 IDO蛋白在SKOV-3/shIDO细胞中表达被抑制,在SKOV-3和SKOV-3/Mock细胞中有表达。3组肿瘤细胞体外生长曲线比较差异无统计学意义（P〉0.05）。SKOV-3/shIDO细胞存活的百分比明显低于其他2组对照（SKOV-3和SKOV-3/Mock）细胞,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论本研究应用shRNA沉默IDO基因表达质粒稳定转染卵巢癌细胞SKOV-3,获得IDO无表达卵巢癌细胞SKOV-3/shIDO,结果显示抑制IDO表达对卵巢癌细胞体外生长速度无影响,但可增强卵巢癌细胞SKOV-3对NK细胞杀伤作用的敏感性。因此,IDO可以作为卵巢癌基因治疗的潜在新靶点,shRNA沉默IDO基因表达可以作为卵巢癌治疗的新方法。     

RNA 干扰沉默缺氧诱导因子1α逆转肺癌细胞耐药性

目的:观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对肺癌细胞耐药性的影响。方法:构建靶向HIF-1α小干扰RNA基因,并转染到人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞中。逆转录聚合酶链反应RT-PCR)检测细胞的HIF-1α、多药耐药基因1(MDR-1)以多药耐药相关蛋白基因(MRP)mRNA变化,免疫细胞化学法观察干扰后HIF-1α、P-糖蛋白以及MRP蛋白的变化。MTT法检测不同浓度的顺铂作用下细胞死亡率。结果:HIF-1αsiRNA组中HIF-1α、MDR-1、MRP mRNA水平显著降低(P<0.05),且蛋白水平也显著下降(P<0.05)。HIF-1αsiRNA组细胞死亡率较未转染组均明显增高(P<0.05),转染siRNA阴性组不影响肿瘤细胞的耐药性。结论:HIF-1αsiRNA可显著降低A549/DDP细胞中HIF-1α、MDR-1、MRP表达,从而起到逆转肺腺癌A549/DDP细胞的耐药作用。     

siRNA对肝纤维化的抑制作用

目的：研究肝星状细胞（use）中smad2特异性小干扰RNA（siRNA）对I型胶原表达的抑制作用,探讨抗肝纤维化的基因治疗新方法。方法：设计合成靶向Smad2基因的siRNA,将筛选成功的siRNA瞬时转染入体外培养的肝星状细胞（HSC）,并给予转化生长因子p（TGF．B）刺激,应用RT—PCR和Westernblot技术检测对照组与实验组I型胶原mRNA水平和蛋白水平表达差异,研究siRNA对I型胶原表达的抑制作用。结果：siRNA能明显降低肝星状细胞中Smad2的RNA和蛋白的表达水平,证实筛选的siRNA有效,能特异性抑制Smad2的基因表达;TGF-β刺激肝星状细胞后,与对照组比较,siRNA转染组细胞外基质（ECM）成分I型胶原的表达水平明显降低（P〈0．05）。结论：siRNA能够抑制TGFβ对肝星状细胞的激活,阻断TGFB—Smads传导通路,使I型胶原分泌下调,有效抑制TGFB诱导的肝纤维化。     

ADAR1 shRNA对人胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究ADAR1 shRNA对人胶质瘤细胞U87细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过构建ADAR1-shRNA的干扰质粒,经脂质体法转染胶质瘤U87细胞系,通过荧光倒置显微镜观察转染效率,选择转染效率最高的细胞系。取转染48h细胞,采用RT-PCR和Western-blot分别检测ADAR1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测其细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖情况。结果:①经ADAR1-shRNA转染48h后的转染效率最高,此时U87细胞系中ADAR1 mRNA及蛋白的表达均被显著抑制,较阴性对照组及空白组均明显降低(P0.05)。②在转染ADAR1-shRNA后,细胞凋亡率为(28.14%±3.76%),明显高于阴性对照组(3.20%±1.57%)和空白组(2.80%±1.49%),细胞增殖率较阴性对照组及空白组明显下降(P0.05)。结论:通过shRNA抑制ADAR1的表达能明显促进人胶质瘤细胞U87细胞的凋亡和抑制其增殖,ADAR1基因可能成为治疗治疗胶质瘤的新靶点。     

RNA干扰Ezrin体外对肾癌细胞株786-0增殖、凋亡的影响

目的：构建膜- 细胞骨架联接蛋白Ezrin 基因特异性短发卡RAN 表达载体（small hairpin RNA,shRNA）,探讨其对肾癌细胞株786-0 细胞凋亡、增殖的影响。方法：以Ezrin 为靶基因,以Pgenesil-1 质粒为载体,设计和构建重组体,设计2 条发夹式RNA（shRNA）,合成后克隆入载体Pgenesil-1,扩增并中量提取质粒,应用脂质体Lipofectamine 2000 转染进786-0 细胞,重组质粒转染786-0 肾癌细胞株,用运实时荧光定量PCR 进行筛选鉴定,筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-Ezrin1,用shRNA-Ezrin1转染786-0 细胞,采用MTT、流式细胞仪、电镜检测,观察RNA干扰Ezrin 后肾癌细胞株786-0 细胞增殖能力的改变。结果：shRNA干扰后786-0 细胞增殖活性减弱,G0/G1时段明显延长（P〈0.01）,PI缩短（P〈0.01）,细胞凋亡率增加（P〈0.01）。结论：Ezrin与肾癌细胞凋亡、增殖有关,有望成为肾癌基因治疗的一个新靶点。     

结肠癌细胞株和组织中EGFR、p-EGFR和p-IGFR-1β的表达及意义

目的：研究EGFR、p-EGFR和p-IGFR-1β在结肠癌细胞株的表达及其与吉非替尼敏感性的关系,以及在肿瘤组织中的表达状况、相关性及其与临床病理参数的关系。方法：以western blot检测EGFR、p-EGFR和p-IGFR-1β在结肠癌细胞株和组织中的表达,以Quantity One软件测量各蛋白条带的灰度值。结果：EGFR、p-EGFR在Lovo细胞中表达量最高（P〈0.05）,EGFR在SW620细胞中的表达最低（P〈0.05）,在HCT116、HT29、LS174T和SW480细胞中的表达差异不显著。p-IGFR-1β在Lovo、HT29和SW480细胞中表达较弱,且在Lovo细胞中表达更弱,但在HCT116、LS174T和SW620细胞中的表达均较强（P〈0.05）。结肠癌组织中EGFR表达率为55.6%（10/18）,癌旁正常组织为37.5%（3/18）,肿瘤组织中有表达增高的趋势;p-EGFR在结肠癌组织表达率为33.3%（6/18）,较正常组织的5.6%（1/18）明显增高（P〈0.05）;p-IGFR-1β在结肠癌组织表达率为44.4%（8/18）,较正常组织的11．1％（2／18）明显增高（P〈0．05）。EGFR、P-EGFR和P-IGFR-1β相互之间的表达无明显相关性;EGFR、P-EGFR表达与各临床病理参数无明显相关;P．IGFR-1β在淋巴结转移患者中的表达显著增高（P〈0．05）,且在分期晚的患者中也可观察到这种趋势。结论：结合我们以往的研究结果,P．EGFR表达高伴p-IGFR-1β表达低提示结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性好。P-EGFR和P—IGFR-1β在结肠癌组织中的表达较正常组织明显增高,且p-IGFR．1B表达高可能预示结肠癌患者有较高的转移风险。     

FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响

目的：构建FXYD6短发夹RNA（shRNA）表达载体,体外评价其对胰腺癌细胞sw1990的增殖与FXYD6蛋白表达的抑制效果。方法：基于microRNA mir-30天然结构,设计表达4对FXYD6 shRNA的互补DNA序列,克隆入pCGM30质粒载体,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR法筛选阳性克隆,经酶切和基因测序鉴定;利用LipofectAMINE2000将pCGM30-FXYD6shRNA转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖的变化,Western blot检测胰腺癌细胞中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果：设计合成了4对表达FXYD6 shRNA的互补DNA序列,构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒;基因测序证实shRNA编码序列与设计的片段完全一致,酶切鉴定证实载体构建成功;体外实验表明,转染胰腺癌细胞sw1990的增殖能力和FXYD6蛋白表达水平明显降低（P〈0．05）,FXYD6蛋白表达水平随时间延长逐渐降低（P〈O．01）,但细胞增殖能力无明显变化（P〉0．05）。结论：构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒载体,可有效抑制FXYD6的表达;抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞的增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。     

Survivin和RhoA双基因沉默对卵巢癌细胞的增殖与侵袭影响

目的：探讨RNA干扰（RNAi）双向沉默Survivin和RhoA基因表达对人卵巢癌H08910PM细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法：构建Survivin和RhoA基因的串联microRNA干扰载体（Survivin-RhoA-microRNA）,通过脂质体介导转染人卵巢癌H08910PM细胞作为实验组,对照组为空载体转染组。转染48小时后,RT—PCR检测Survivin和RhoA的mRNA表达,Western．Blot检测Survivin和RhoA的蛋白质表达;利用MTT法、Transwell小室体外侵袭实验及流式细胞术检测转染后卵巢癌细胞的增殖、侵袭及凋亡情况。结果：Survivin—RhoA—microRNA明显抑制了H08910PM细胞中Survivin和RhoA基因mRNA和蛋白的表达：转染48小时后,实验组SurvivinmRNA和RhoAmRNA表达抑制率分别为68．82％、90．23％,Survivin和RhoA蛋白表达抑制率分别为63．91％、88．47％;MTT分析显示实验组细胞OD490的值为0．706±0．177,较对照组（1．172±0．241）明显降低,差异有统计学意义（P〈0．05）;流式细胞术检测实验组细胞凋亡率为36．41±3．34％,较对照组（2．92±0．78％）明显升高（P〈0．01）;实验组细胞侵袭百分比为12．56±6．17％,较对照组（32．96±5．14％）明显降低（P〈0．05）。结论：成功构建Survivin和RhoA串联microRNA干扰载体（Survivin．RhoA．microRNA）。Survivin和RhoA双基因沉默显著抑制了卵巢癌H08910PM细胞的增殖和侵袭能力,并增加其凋亡率,两者具有协同作用,为双靶点治疗卵巢癌提供了新的思路和策略。     

靶向下调FOXM1基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真核转录载体pSilencer1．0-U6-FOXMI—shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量·聚合酶链反应（Real—timeqPCR）、蛋白免疫印迹法（Westemblot）分别检测FOXMl基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSileneerl．0-U6-FOXMl-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P〈0．05）,平板克隆形成显著减少（P〈0．05）,重组载体转染后显著抑制MDA—MB-231细胞中FOXM1基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXMI基因对乳腺癌细胞株MDA—MB-231生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

沉默MDR1基因增强急性早幼粒白血病耐药细胞HT9药物敏感性

该研究利用短发卡RNA（small hairpinin RNA,shRNA）表达载体沉默HT9急性早幼粒白血病耐药细胞MDRl基因表达,以提高细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。通过设计合成编码shRNA的DNA模板序列,定向克隆到pSilencer2．1－u6neo质粒,成功构建1个P－gP蛋白基因特异的shRNA表达载体,稳定电转染HT9细胞,实时荧光定量PCR分析MDRlmRYAg表达,Westem blot检测细胞P—gp蛋白表达,流式细胞术检测P—gP蛋白外排泵功能,MTT法检测细胞对药物敏感性。结果显示,成功构建了shRNA表达载体pSilencer2-1-U6neo—MDRl,转染HT9细胞后,PCR检测重组质粒整合到HT9／sh－2－1－1细胞基因组DNA,获得稳定遗传;HT9／sh－2－1—1细胞MDRlmRNA表达降低了78．84％（P〈0．01）,P—gP蛋白表达降低了48．27％（P〈0．05）,细胞内Rh0123相对荧光强度由（10．8±0．58）％升高至（73．56±1．37m;转染细胞对三尖杉酯碱、阿霉素敏感性明显增强,IC50分别由（2．06±0．15）gmol／L降至（0．57±0．01）gmol／L、（4．04±017）gmol／L降至（1．56±0．05）μtmol／L。提示shRNA干扰表达载体pSilencer2．1－U6neo—MDRl能够稳定、持久地抑制MDRI基因表达,并能有效增强HT9细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。     

RNA干扰PLCε诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的实验研究

目的探讨以RNA干扰沉默人源磷脂酶Ce(phospholipase Cepsilon,PLCε)基因表达后诱导人膀胱癌细胞株BIU-87细胞凋亡的作用和机制。方法脂质体介导重组阳性质粒pGenesil-PLCε(以下简称P)和阴性质粒pGenesil-NP(以下简称NP)转染BIU-87细胞48h后,用RT-PCR和Western blot检测转染前后PLCεmRNA和蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率,电镜观察细胞形态改变。结果转染P质粒后可明显抑制PLCεmRNA和蛋白表达水平,抑制率分别为78.7%和76.6%;流式细胞术显示P质粒转染组细胞周期发生改变呈明显G0/G1期阻滞,并出现亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率增加(P0.05);电镜观察P质粒转染组细胞可见凋亡小体。结论:RNA干扰沉默PLCε基因表达可诱导膀胱癌BIU-87细胞凋亡,其作用机制与细胞周期分布的改变有关。