细胞自噬促进柯萨奇病毒B3复制的研究

本研究探索柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)感染引起的自噬与病毒复制之间的关系。CVB3感染HeLa细胞,并在病毒感染后6 h、8 h和10 h时检测LC3-Ⅰ蛋白、LC3-Ⅱ蛋白和p62蛋白的表达水平。结果显示CVB3病毒感染促使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,同时降低p62蛋白的表达。分别将自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamy-cin)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)或溶酶体抑制剂阿洛司他丁(Aloxistatin,E46D)预处理HeLa细胞2 h,CVB3感染药物处理细胞并在病毒感染6 h后收集细胞、检测CVB3病毒VP1蛋白的表达。结果显示雷帕霉素和E64D促使CVB3病毒VP1蛋白表达增加,而3MA降低CVB3病毒VP1蛋白的表达。本研究得出结论 CVB3病毒感染诱导自噬进而促进病毒复制。     

柯萨奇B3病毒基因在重组痘苗病毒中的表达

将编码柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２的基因,分别克隆到具有７．５ｋ启动子的痘苗病毒表达载体ｐＧＪＰ５上;将ＣＶＢ３衣壳蛋白全基因克隆到具有Ｔ７启动子的痘苗表达载体ｐＴＭ１上,并筛先到相应的重组痘苗病毒ＶＶＰ１、ＶＶＰ２和ＶＶＰ／４／２／３／１。ＶＶＰ１和ＶＶＰ２稳定表达产物为ＣＶＢ３衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２,而ＶＶＰ４／２／３／１为一无分泌性的多聚蛋白,且这三种表达产物均属无分泌性     

白藜芦醇通过Nrf2/ARE通路减轻柯萨奇病毒B3感染的乳鼠心肌细胞炎症和氧化应激反应

柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)是引起病毒性心肌炎的主要病毒株,CVB3感染能够通过激活炎症反应及氧化应激反应来造成心肌细胞损伤。白藜芦醇(Resveratrol,RES)是具有抗炎、抗氧化作用的多酚化合物,已经被证实能够减轻缺血缺氧、缺氧复氧、脂多糖、过氧化氢等病理因素引起的心肌细胞损伤,但RES对CVB3感染引起心肌细胞损伤的保护作用尚未明确。为了研究RES通过核因子-E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)通路减轻CVB3感染乳鼠心肌细胞的炎症和氧化应激反应,本研究采用原代培养大鼠乳鼠心肌细胞,分为DMEM处理的对照组、CVB3感染的CVB3组、CVB3感染及RES处理的RES组、CVB3感染及RES、Nrf2抑制剂鸦胆苦醇处理的RES+鸦胆苦醇组、CVB3感染及RES、血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)抑制剂锌原卟啉-9(Zinc protoporphyrin-9,ZnPP9)处理的...     

毛壳素显著抑制柯萨奇病毒 B3的体外复制

柯萨奇病毒B3（CVB3）是一种常见的人类病原体,与多种疾病有关。本研究旨在探讨球毛壳菌代谢产物毛壳素对CVB3在体外培养细胞系中复制的影响。结果显示,毛壳素显著抑制CVB3在体外培养细胞系中的复制。250 nmol/L毛壳素可使 CVB3感染的 HeLa细胞相对存活率从未加毛壳素时的（21．9±1．8）％提高至（70．1±4．3）％。同时,毛壳素处理的HeLa细胞中病毒产量仅为对照组的（5．3±0．8）％,而病毒RNA水平也仅为对照组的（13．0±8．3）％。毛壳素也可使CVB3感染的Vero细胞相对存活率从（64．6±1．7）％提高至（87．2±4．8）％。毛壳素的这种抑制作用可被抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸部分抑制。研究毛壳素抑制病毒复制的具体作用机制将有助于新型抗病毒药物的研制。     

柯萨奇B3病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达

本文通过融合柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）ＶＰ１基因与人凝血酶基因,使ＣＶＢ３的ＶＰ１在大肠杆菌中得到稳定的表达,经蛋白扫描仪等测定,表达的融合蛋白占体可溶性蛋白的１１％左右,表牵ＶＰ１产物与抗ＣＶＢ３ＶＰ１单克隆抗体和小鼠抗ＣＶＢ３血清产生较强的免疫反应。与天然的ＣＶＢ３蛋白抗原性相同,应用无关单抗和载体质粒对照均呈现阴性反应,应用表达的ＶＰ１作为抗原,我们对临床部分急性病毒性心肌炎患者血清进行了特     

失配双链核糖核酸抑制柯萨奇B3病毒感染细胞的研究

通过药物抑制病毒致细胞病变效应实验和药物对病毒空斑形成抑制实验,研究低毒性失配双链核糖核酸（Poly I：C12u）和已知的抗病毒药物双链核糖核酸聚肌胞（Poly I：C）在细胞水平对柯萨奇病毒感染的抑制作用比较,证明Poly I：C12U的抗病毒作用。实验结果表明Poly I：C12U和Poly I：C均可有效地抑制病毒空斑的形成,且量效关系已确定。     

B3型柯萨奇病毒上调NF-κB引起胰岛β细胞凋亡的作用及机制研究

B3型柯萨奇病毒（Coxsackie virus B3,CVB3）与1型糖尿病发病、胰岛功能破坏有关,但CVB3对胰岛β细胞凋亡的影响及机制尚不清楚。本研究的目的是观察CVB3上调NF-κB p-p65引起胰岛β细胞凋亡的作用及机制,进而初步探究CVB3感染引起胰岛β细胞损伤的分子机制。本研究培养了人胰岛β细胞株,分为对照组、CVB3组、阴性对照（NC）质粒组、NF-κB p65质粒组、si-NC组、si-NC+CVB3组、si-NF-κB p65+CVB3组,检测细胞活力A490水平、细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65、IκB α的表达水平。结果显示与对照组比较,CVB3组的A490水平及细胞中IκB α的表达水平降低,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65的表达水平增加（P<0.05）;与NC质粒组比较,NF-κB p65质粒组的A490水平降低,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3、NF-κB p-p65的表达水平增加（P<0.05）;与si-NC+CVB3组比较,si-N...     

柯萨奇病毒B3型感染引起HeLa细胞内源性小干扰RNA的变化

探究柯萨奇病毒B3型(Coxsackie virus type B3, CVB3)感染的细胞是否诱导内源性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的产生。以CVB3接种HeLa细胞,在细胞培养箱(5% CO2、37 ℃)孵育1 h。随后加入含2%血清的细胞维持液,继续培养3 h和6 h后收集细胞。用高通量测序(二代测序) 试剂盒提取细胞RNA,并反转录合成cDNA,构建文库,上机测序。过滤数据,去除插入片段过长的序列、低质量序列、poly A序列和小片段序列,与已知的小RNA数据库比对鉴定siRNA。通过茎-环反转录-聚合酶链反应,证实内源性siRNA在感染CVB3后的表达。结果显示,感染CVB3 3 h和6 h后,HeLa细胞产生了多种内源性siRNA。其中内源性siRNA(novel_sir3502和novel_sir2806)在感染后3 h和6 h均可持续表达。经比对,novel_sir3502和 novel_sir2806均可以识别45S和28S核糖体前体RNA。结果提示,CVB3感染可能干扰核糖体成熟。     

高压力制备柯萨奇病毒疫苗

以HeLa细胞和BALB／c小鼠为模型,研究了高压力对柯萨B组病毒（CVB）感染活性和免疫原性的影响,发现在230MPa压力下,结合其他相应的物理条件,CVB的感染活性可完全消失。该CVB仍具有抗原性,可诱导小鼠产生CVB特异性抗性,效价可达1：1500。用高压力处理的CVB免疫小鼠,再用正常CVB攻击,其生存率为67％,具有疫苗的特性。这些结果表明,高压力处理的CVB具有免疫保护作用,可作为一种具有潜在应用前景的病毒疫苗。     

柯萨奇病毒B5的VP1区域基因特征分析及蛋白二级结构预测

柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CVB5)感染人体后可引起一系列疾病,包括上呼吸道感染、腹泻、手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)、病毒性脑炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、弛缓性麻痹、扩张性心肌炎以及糖尿病等症状。为了解云南省手足口病和疱疹性咽峡炎患者中CVB5的分子特征,本研究从2018-2019年昆明市儿童医院收集的HFMD和疱疹性咽峡炎(Herpangina,HA)患者粪便中分离得到9株CVB5,基于CVB5的VP1区的系统进化树以及蛋白二级结构的预测来分析分离株的基因序列特征以及与CVB5原型株Faulkner之间的差异,并对CVB5的分子流行病学特征进行分析。结果显示,2018-2019年分离株均属于E基因簇,与Faulkner株相比,所有分离株的VP1区域的氨基酸出现共同的10个氨基酸突变且增加了1个蛋白连接位点。本研究初步探索了肠道病毒CVB5进化过程中突变导致患者症状的差异以及揭示CVB5的全球流行趋势。     

柯萨奇B3病毒对心肌细胞离子通道电流的影响

目的 :探讨柯萨奇B3病毒 (coxsackievirusB3,CVB3)对大鼠心肌细胞离子通道的影响 ,以了解病毒感染导致细胞电生理活动异常的机理。方法 :酶消化法获得单个心肌细胞后利用膜片钳全细胞电流记录技术观察CVB3对L型钙通道电流、钠通道电流、外向钾电流和内向整流性钾电流的影响。结果 :CVB3感染使L型钙通道电流、外向钾电流增加 ,内向整流性钾电流减小 ,对钠通道电流无明显影响。结论 :CVB3对L型钙通道电流、外向钾电流和内向整流性钾电流的影响可能是病毒感染后细胞损伤和产生异常电活动的原因。     

盐酸阿比朵尔抗柯萨奇病毒B3的实验研究

为观察盐酸阿比朵尔对柯萨奇病毒的抑制作用,本实验以利巴韦林为阳性对照药物,采用细胞培养技术、细胞病变效应(CPE)抑制法、活细胞染色计数法(MTT)和培养上清中病毒滴度测定观察盐酸阿比朵尔抗柯萨奇病毒的作用。结果表明盐酸阿比朵尔的半数中毒浓度(TD50)为896.54μg/mL,药物抗病毒生物合成组、药物直接作用组、药物抗病毒吸附2h组、药物抗病毒有吸附8h组的病毒抑制率分别能达到74.48%、45.68%、28.90%和48.27%,在抗生物合成组,盐酸阿比朵尔能明显抑制柯萨奇病毒所致的CPE效应,降低培养上清中的病毒滴度,病毒抑制率随药物浓度增加而增高,存在量效关系。这提示盐酸阿比朵尔在细胞内对柯萨奇病毒有一定的抑制作用。     

前列腺癌组织及PC-3细胞中STAT3及磷酸化STAT3的表达

目的　研究前列腺癌组织及前列腺癌细胞株PC- 3 中STAT3 蛋白及磷酸化STAT3 蛋白的表达。方法　常规石蜡包埋切片SABC免疫组化法检测45例前列腺癌组织、20例前列腺增生组织中STAT3 及磷酸化STAT3 表达, 细胞免疫化学法检测前列腺癌细胞株PC 3细胞STAT3及磷酸化STAT3表达。结果　STAT3在前列腺癌及前列腺增生组织表达阳性率分别为77. 8%和50. 0%, 两者间具有显著差异; 磷酸化STAT3在前列腺癌及前列腺增生组织表达阳性率分别为68. 9%和35. 0%, 两者间具显著差异(P<0 .05); PC- 3细胞中STAT3及磷酸化STAT3表达阳性。结论　STAT3蛋白在前列腺癌中高表达且持续激活, 可能与前列腺癌的发生具有密切联系。     

Therapeutic potential of RNA interference against cellular targets of HIV infection

RNA interference is not only very promising in identifying new targets for drug development, siRNA/shRNA themselves may be directly used as therapeutic agents. In inhibiting viral infections by RNA interference, both viral targets and cellular proteins have been evaluated. Most of the early studies in this field had chosen viral targets for RNA interference. However, recent efforts are mainly focusing on cellular proteins for RNA silencing due to the realization that a variety of viral responses substantially minimize siRNA effects. With the application of siRNA approaching, many new cellular targets relevant to HIV infection have been identified. The value of siRNA/shRNA in the treatment of AIDS is largely dependent on better understanding of the biology of HIV replication. Efforts in the identification of cellular processes with the employment of siRNA/shRNA have shed some new lights on our understanding of how HIV infection occurs. Furthermore, the relative specific effects and simplicity of design makes siRNA/shRNA themselves to be favorable drug leads. J. Zhang and Y. O. Wu contributed equally to this article.     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因的体外表达鉴定

将克隆的CVB3 VP1基因亚克隆至真核表达载体pCEP4构建CVB3 VP1的真核表达质粒pCEP4-CVB3VP1.pCEP4-CVB3VP1转染HeLa细胞,蛋白印迹试验证明该表达体系可以在体外表达能为CVB3中和抗体识别的VP1蛋白.本研究为CVB基因疫苗的研究提供了实验依据.     

大肠杆菌RNA聚合酶σ亚基基因的表达及表达产物的分离纯化

将2种表达质拉pEGMD（含rpoD基因）和pETF（含rpoS基因）转化到BL21（DE3）菌株中,培养菌体。破碎细胞,用盐酸抓溶解包含体,经DEAE－纤维素柱层析,SDS－PAGE检测可得纯化σ的蛋白。通过紫外分光光度法测定蛋白浓度,实验表明σ38蛋白的得率为菌体温重的0．27％,σ70蛋白的得率为菌体湿重的0．06％。     

RNAi及DNA芯片分析肝癌细胞系中受DNMT3B调控的下游基因

为揭示DNA甲基转移酶3B（DNMT3B）在肝癌中是否参与了肿瘤的发生,应用Western blotting及细胞免疫化学方法分析DNMT3B蛋白在人的正常肝细胞株、肝癌癌旁细胞株及肝癌癌细胞株中的表达。构建了DNMT3B的RNAi稳定表达的重组载体,并转染人肝癌细胞株SMMC-7721中。以半定量RT-PCR及Western blotting分别鉴定DNM73B RNAi表达载体对内源性DNMT3B的抑制效率。用高通量的cDNA基因芯片分析了SMMC-7721中DNMT3B抑制后有影响的下游基因谱。结果显示,DNMT3B在肝癌细胞株中的表达水平明显高于肝癌癌旁和正常肝细胞株。DNMT3B的RNAi稳定表达重组载体转染SMMC-7721细胞株2个月后,观察到DNMT3B明显受到抑制。cDNA基因芯片分析发现,DNMT3B抑制后诱导26条基因表达下调,115条基因表达上调,包括一些发育相关基因以及肿瘤相关基因,如SNCG、NOTCH1、MBD3、WNT11、MAOA、FACL4等。提示DNMT3B的高表达可能与肝癌的发生有关,并以调控其他相关基因的表达而起作用,包括与发育相关的重要基因。