白地霉的戊糖代谢——Ⅰ.木糖代谢的初步变化途径

(1)用在木糖上培养的白地霉2.361无細胞提取液进行了木糖代謝酶体系的研究。查明木糖代謝的初步变化途径如下: D-木糖 TPNH H~ →木糖还原酶←木糖醇 TPN~ (1) 木糖醇 DPN~ →木糖醇脫氫酶←D-木酮糖 DPNH H~ (2) D-木酮糖 ATP→D-木酮糖激酶D-木酮糖-5-磷酸(3) (2)催化式(1)的酶为木糖还原酶,需要TPN。用紙层析法鉴定木糖还原的产物为木糖醇。(3)催化式(2)的酶称木糖醇脫氫酶,需DPN。(4)催化式(3)的酶为D-木酮糖激酶,所試过的其他戊糖在同样条件下均不被磷酸化。(5)白地霉无細胞提取液中测不出木糖(?)构酶的活力。排除了这一途径的可能性。(6)催化式(1)(2)(3)各反应的酶均有适应形成的特性,符合Stanier的連續适应学說。     

白地霉的戊糖代谢 Ⅱ.L-阿拉伯糖代谢途径

用在L-阿拉伯糖上培养的白地霉(Geotrichum candidum Link)2.361无细胞提取液进行了L-阿拉伯糖代谢酶体系的研究。查明L-阿拉伯糖代谢的变化途径如下: L-阿拉伯糖+NADPH_2 戊醛糖还原酶L-阿拉伯糖醇+NADP L-阿拉伯糖醇+NAD L-阿拉伯糖醇脱氢酶L-木酮糖+NADH_2 L-木酮糖+NADPH_2 NADP-木糖醇脱氢酶木糖醇+NADP 木糖醇+NAD NAD-木糖醇脱氢酶D-木酮糖+NADH_2 D-木酮糖+ATP D-木酮糖激酶→D-木酮糖-5-磷酸+ADP L-阿拉伯糖醇脱氢酶仅存在于L-阿拉伯糖培养的菌体中,而不存在于木糖培养的菌体中。可见它与木糖醇脱氢酶不是同一个酶。这一点与文献报导的不同,在黄青霉中这两种酶活力被认为是同一种酶的作用。     

谷氨酸发酵菌——Brevibacterium ketoglutaricum nov.sp.北京2990-6的代谢 还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸的氧化

(1)对2990-6号菌的NADH_2,NADPH_2的氧化酶系和转氢酶做了初步的观察并与2990-6号菌在发酵产生大量谷氨酸时的酶系活力的变化做了比较。(2)本工作表明NADH_2氧化酶系以及某些与NAD联结的脱氢酶,NADPH_2氧化酶系以及某些与NADP联结的脱氢酶在细胞内的分布上有着明显的区分。(3)应用比较简便的方法测定了2990-6号菌在各不同生理状态下的NAD,NADH_2,NADP,NADPH_2的含量。(4)对2990-6号菌的谷氨酸发酵机制作了简要的讨论。     

链霉菌的菸酰胺核苷酸酶

发現鏈霉菌的細胞抽出液能够抑制以NAD或NADP作为受氫体的脫氫酶的反应系統中还原型輔酶的形成。实驗証明,这种抑制作用的原因是細胞抽出液中存在有菸酰胺核苷酸酶,它能迅速地水解菸酰胺輔酶,而使脫氫酶无法表現其活力。这一发現足以解析为什么在鏈霉菌的抽出液中一直不能測出各种脫氫酶的活力来。鏈霉菌的菸酰胺核苷酸酶与已知各种来自动物或微生物的菸酰胺核苷酸酶不同,鏈霉菌中酶的特点是: (1)經純化以后,酶制剂中仍含有核酸。(2)对某些蛋白貭变性剂与对热非常稳定,在除去酶制剂中的DNA以后,其对热稳定性即行降低;向已去核酸的酶中加入核酸或其分解产物,可以使其对热稳定性恢复、甚至超过原来的水平。(3)在pH5.5—9.0之間,酶活力相等,但在去除酶制剂中的核酸以后,出現了酶活力的最适pH值。     

蚕氨基酸代謝之研究——Ⅵ.家蚕与蓖麻蚕的谷氨酸脫氫酶

在家蚕与蓖痲蚕的脂肪体,絲腺后部和中腸組織中,利用分光光度法,都观察到谷氨酸脫氫酶。将α-酮戊二酸与NH_4~+加于以上各种組織的酶液中,測定NADH_2的氧化,証实了其逆向反应的存在。蚕組織中的谷氨酸脫氫酶需要NAD为其輔酶。在家蚕与蓖痲蚕的絲腺后部中,我們利用直接測定的方法,观察到БраунШтеЙн所提出的轉氨-脫氨作用的存在,从而进一步說明谷氨酸脫氫酶在氨基酸代謝中的重要地位。此外,我們尚发現在不同发育阶段,蓖麻蚕脂肪体中谷氨酸脫氫酶的活力表現显著的变化。     

白地霉糖代谢酶体系的研究

除磷酸己糖激酶外,在白地霉无細胞提取液中测出有EMP途径及磷酸戊糖循环的主要酶类,葡萄糖和木糖培养的菌体在各酶活力方面无显著差异。用葡萄糖-C~(14)进行的呼吸实驗表明两种糖培养的菌株在不同代謝途径的相对比重方面也无明显差异。     

白地霉NADP-甘露醇脱氢酶的提纯及其性质

白地霉无细胞提取液经热处理,硫酸铵沉淀,乙醇分段和DEAE-纤维素柱层析,已将NADP-甘露醇脱氢酶提纯了200倍。用免疫电泳法鉴定其为单一组分。该酶只能以NADP+作为氧受体,能氧化甘露酵、山梨醇、D-阿拉伯糖醇及木糖醇。对底物的亲和力较小。巯基是其必需基团。受一些金属络合剂所抑制。该酶氧化甘露醇最适pH为7．7,还原果糖最适pH为6．8。平衡常数为6．23×10-9M。     

亚硝酸诱变导致枯草杆菌中L-丙氨酸脱氢酶对L-谷氨酸脱氢酶的转换 Ⅰ.二个脱氢酶在某些性质上的相似

枯草杆菌野生型菌株(細胞內仅有L-丙氨酸脫氫酶ADH,没有L-谷氨酸脫氫酶GDH),經亚硝酸处理后引起突变。变种菌株沒有ADH,但获得GDH。将野生型細菌中的ADH与变种細胞中的GDH分別純化60倍后,比較它們的性貭,发現这两种脫氫酶在DEAE-纤維素柱层析,与热稳定性方面均无区別,ADH与GDH的动力学常数也非常相似。只有在免疫学反应方面,这两者有較明显的不同。由于这两种脫氫酶的性貭非砄嗨?同时野生型菌株(ADH~+)經亚硝酸誘发成GDH~+变种以及GDH~+变种誘发回变为野生型的頻率都相当高。因此我們认为因突变而使細菌細胞內ADH轉换为GDH可能由于一点变异所引起。     

孔雀绿定磷法测定植物NADP磷酸酶活性

AMethodofPhosphateDeterminationUsingMalachiteGreenFitfortheMeasurementofNADPPhosphataseActivityYANGWan-Nian,HEZhi－Chang（CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072)NADP磷酸酶催化NADP水解生成NAD和磷酸：NADP＋H2O→NAD＋Pi。该酶与NAD激酶一起参与NAD和NADP水平的调节。其活性通过乙醇脱氢酶循环反应生成的NAD确定［1］。该方法虽然比较灵敏,但操作比较繁琐,反应条件不易控制。孔雀绿定磷法是一种灵敏度很高的测定无机磷的方法［2,3］已用于ATP酶［2,3,4］活性及钙调素含量[3]的…     

耐高渗透压酵母产生甘油及阿拉伯糖醇的研究IV．耐高渗透压酵母的糖代谢途径

1．测定了两株耐高渗透压酵母(Hansenula arabitolgenes Fang．275及 Zygosaacharo-myces cheyalieri Guill．2．309)无细胞提取液中EMP 及磷酸戊糖循环的酶活力,除在2．309中未能测出磷酸果糖激酶外,其他所测备酶在两株酵母中均有活力。 2．在两株酵母中均有联系NADP的多元醇脱氢酶,催化二攫丙酮还原为甘油(275厦2．309中)以及D-核酮糖还原为D一阿拉伯糖醇(仅在275中)。 3．用葡萄糖-C14的呼吸实赊表明在275号酵母中磷酸戊糖循环占较大比重,这与它能产生大量五碳化合物——阿拉伯糖醇是相符的。     

豌豆NAD激酶的提纯及活力测定

NAD激酶(ATP:NAD 2′-磷酸转移酶EC 2.7.1.23简称NADK)催化NAD磷酸化生成NADP,其活性随着酶的纯化而降低,其激活依赖于Ca~(2 )激活的钙调素(Calmod-ulin简称CaM),两者之间成剂量关系,因此,可用该酶定量CaM。活性CaM一般采用酶法[如环腺苷酸磷酸二酯酶(PDE)和红血球Ca~(2 )-ATP酶等]定量,但采用这类酶时,酶活性易受磷酯与脂     

嗜热共生杆菌内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶中Y76对辅酶偏好性影响

辅酶NAD(H)相比NADP(H)有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环方法等优势,因此在实际应用中常需将NADP(H)依赖型的脱氢酶改造成为NAD(H)依赖型的。来源于嗜热共生杆菌Symbiobacterium thermophilum的NADP(H)依赖型内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-2,6-diaminopimelate dehydrogenase,St DAPDH)及其突变体酶是催化还原氨化合成D-氨基酸的优良催化剂,本研究试图改变其辅酶偏好性,增强其应用优势。对其晶体结构分析可知,氨基酸残基Y76距离腺嘌呤较近,R35及R36和辅酶上磷酸基团有直接相互作用。依氨基酸侧链基团性质对Y76进行了定点突变,发现不同突变子对两种辅酶的偏好性都发生了变化;对与磷酸基团直接作用的R35、R36进行的双突变R35S/R36V,导致酶对NADP+的催化活力降低;将R35S/R36V和部分Y76突变进行了组合,发现三突变组合以NAD+为辅酶时的活力均大于以NADP+为辅酶的活力,实现了辅酶偏好性转变。这些研究工作为进一步实现St DAPDH的辅酶偏好性完全转变提供依据。     

日本血吸虫琥珀酸氧化酶的研究

应用測压法和分光光度法証明了日本血吸虫含有琥珀酸氧化酶,琥珀酸脫氫酶,琥珀酸-細胞色素c还原酶和細胞色素氧化酶等完整系統。血吸虫的琥珀酸氧化酶活力与細胞色素c浓度有关,浓度增加,酶活力上升,在0.4×10~(-5)—2×10~(-5)M之間与酶活力成直綫关系。酶活力与磷酸盐浓度亦有一定关系,浓度愈低,酶活力愈強。在酶作用的最适条件下(琥珀酸鈉,0.02M;細胞色素c,2×10~(-5)M;磷酸盐緩冲液,0.01M,pH7.4)測定合抱成虫匀浆的酶活力,結果为:氧耗量Qo_2=30.3微升/小时/毫克氮量;琥珀酸耗量Q_S=322微克/小时/毫克氮量;延胡索酸产生量Q_F=157微克/小时/毫克氮量。当雌雄虫分別測定时,在等氮量基础上,雌虫酶活力比雄虫高。丙二酸鈉,二乙基二硫代氨基甲酸鈉(銅試剂)和氰化物都能強烈地抑制琥珀酸氧化酶活力。治疗血吸虫病常用的几种銻剂在2×10~(-3)M时,体外試驗,对此酶活力无明显的抑制作用。此外,氰化物除抑制細胞色素氧化酶外,还能抑制琥珀酸脫氫酶(用甲烯蓝方法測定)。与細胞色素c相似,維生素K_3亦能刺激匀浆的呼吸。此外,我們发現了日本血吸虫匀浆經过加热处理后,可以分离出一种耐热的“还原物貭”,对細胞色素c有化学的还原作用。本文还討論了血吸虫琥珀酸的代謝途径和細胞色素系統在呼吸鏈中可能占有重要地位。     

橘黴素抗生作用之機構 Ⅱ.對於幾種酶系的影響

前文曾報道橘黴素能抑制動物組織和細菌的細胞呼吸。這些結果易使人猜想到此種抗生素可能作用於細胞中存在的酶或酶系。事實上已有人實驗證明橘黴素能抑制金色葡萄球菌的乳酸脫氫酶和微生物的異咯嗪色素酶(flavine enzymes)。現在存在的問題是:橘黴素是否對於其他的酶類,特別是其他呼吸酶類也有顯著作用?是否對於酶都有毒性     

还原辅脱氢酶Ⅱ的氧化问题

利用自动記录白金微氧电极定氧与分光光度計测定的方法,发現大白鼠肝脏微粒体能氧化NADPH。微粒体的NADPH氧化系統活力不受氰化物、双香豆素、2,4二硝基酚、5乙,5(?)戊巴比妥酸鈉与迭氮酸鈉等所抑制。鼠肝匀浆經45,000×g离心所得的上清液不能催化NADPH被氧气所氧化。但含有对双香豆素高度敏感的还原菸酰胺核苷酸脫氫酶,其性貭与Ernster所提出的“DT黃递酶”很相似。微粒体制剂中加入上清液后NADPH氧化系統活力增大約1倍左右。此时若加入双香豆素,則NADPH氧化系統总活力被抑制大約一半。我們认为上清液中对双香豆素敏感的还原菸酰胺核苷酸脫氫酶能通过某种与微罫宓牧到M成NADPH氧化系統。这样NADPH就可以不需通过线粒体氧化。我們认为在鼠肝中NADPH的氧化途径如下: →还原性生物合成NADPH—?→通过綫粒体氧化(包括通过轉氫酶的作用) →微粒体NADPH氧化系統→O_2 →还原菸酰胺核苷酸脫氫酶→微粒体上未知系統(可能和微粒体上NADPH氧化系統部分相同) →O_2     

酿酒酵母中NAD激酶同功酶对偶数位不饱和脂肪酸β-氧化的影响

ATP-NAD激酶利用ATP,催化NAD磷酸化,生成NADP,而ATP-NADH激酶则催化NAD和NADH发生磷酸化。酿酒酵母细胞内存在三种NAD激酶同功酶Utr1p、Pos5p和Yef1p,它们都是ATP-NADH激酶,对细胞内NADP(H)的供应起到重要作用。酵母偶数位双键不饱和脂肪酸的β-氧化依赖于过氧化物酶体基质内的NADPH。通过构建NAD激酶基因的单、双基因缺失株,并验证它们和对照菌株对不饱和脂肪酸的氧化、利用能力,证实NAD激酶同功酶,尤其是Pos5p,对过氧化物酶体基质内NADP(H)的供应起着重要作用,并推测NADP可以从过氧化物酶体膜外转运至过氧化物酶体基质内。     

[α]甘油磷酸氧化酶系的組成部份

(一) 在經徹底冲洗的兔骨骼肌製劑中,[L-α]甘油磷酸和琥珀酸的氧化彼此干涉。琥珀酸對[L-α]甘油磷酸氧化的抑制作用能因加入抑制琥珀酸脫氫酶的焦磷酸而解除。 (二) 當用細胞色素c作受體時[L-α]甘油磷酸,還原輔酶I和琥珀酸三者同時氧化時總氧化速度僅相當其中氧化速度最高者即還原輔酶I單獨氧化的速度。[L-α]甘油磷酸氧化酶系也因[2,3]二氫硫基丙醇的處理而失效。 (三) 當用[2,6]二氯酚靛酚作受體時[L-α]甘油磷酸和琥珀酸同時氧化時速度完全等於二底料單獨氧化時速度的和。[L-α]甘油磷酸的氧化不受苯代氨甲酸乙酯的影響。 (四) 本文結果說明[L-α]甘油磷酸的氧化不通過細胞色素b而通過中間因子和細胞色素c連接。     

基于双酶级联协调表达策略高效催化合成D-甘露醇北大核心CSCD

D-甘露醇(D-mannitol)作为合成抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体被广泛应用于制药和医疗等行业,酶法合成D-甘露醇反应成本昂贵无法满足工业化生产。本研究首先筛选关键酶获得较优性能的甘露醇脱氢酶Lp MDH和用于辅因子NADH再生的葡萄糖脱氢酶Ba GDH,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中共表达,实现了基于双酶级联反应催化底物D-果糖合成D-甘露醇,D-甘露醇的初步摩尔转化率为59.7%。针对双酶级联催化反应中辅酶再生用酶与催化用酶表达量不协调的问题,通过增加Bagdh拷贝量来提高辅因子循环能力,获得了双酶催化速率平衡的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet-Lpmdh-Bagdh-Bagdh。进一步对重组菌的全细胞转化条件进行优化,确定了最适转化条件为反应温度30℃,初始pH值6.5,菌体量OD600=30,底物D-果糖100.0 g/L,辅底物葡萄糖与底物1︰1摩尔当量。于最优转化条件下5 L发酵罐转化24 h,D-甘露醇的最高产量为81.9g/L,摩尔转化率为81.9%。本研究提供了一种绿色、高效生物催化生产D-甘露醇的方法,为实现其规模化生产奠定了基础,同时也对其他相关稀有糖醇的研究具有指导意义。     

米根霉在氮源限制下的木糖代谢和关键酶特性北大核心CSCD

【目的】解析氮源浓度对米根霉木糖代谢途径及产物的影响,提高木糖利用率。【方法】以木糖为碳源,考察不同氮源浓度下米根霉的生物量、有机酸积累量、木糖代谢关键酶(木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)活力以及胞内还原力(NADH/NAD+、NADPH/NADP+)的差异。【结果】富氮条件下(2.4 g/L尿素),木糖代谢速率达2.03 g/(L·h),木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及胞内还原力较高,生物量达18.01g/L,几乎不积累有机酸;限氮条件下(0.15 g/L尿素),木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及胞内还原力水平降低,生物量仅4.02 g/L,富马酸积累量为6.55 g/L,残余木糖量较高;氮源浓度为0.6 g/L时,木糖还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及NADPH/NADP+处于前二者之间,此时生物量9.11 g/L,有机酸积累量较大,其中富马酸为12.28 g/L。【结论】充足的氮源可使米根霉通过木糖代谢关键酶与胞内还原力的协同效应强化木糖代谢活力,通过优化氮源浓度后,米根霉可积累更多有机酸。     

白地霉的氧化代谢

1．自地霍完整静息幼胞氧化乙醇、乙酸、丙酮酸及草酰乙酸的速度很高,对其他三羧酸循环各酸如：琥珀酸、延胡索酸、a-酮戊二酸、苹果酸、柠檬酸、顺岛头酸及异柠檬酸也能氧化,但速度甚低。 2．在白地霉无细胞提取液中测出了三羧酸循环中以下各种酶活力：柠檬酸精合酶、异柠檬酸脱氢酶、顺岛头酸酶、a-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、草酰乙酸羧化酶等,并间接得知有乙酸激活酶及L-谷氨酸脱氢酶存在。 3．在白地霉无捆胞提取液中测出了乙醛酸循环的两个关键的酶皂口异柠檬酸酶及苹果酸合成酶。 4．由以上结果可知白地霉可利用三羧酸循环及乙醛酸循环作为末端呼吸途径。