福氏志贺菌两种血清分型方法的比较

目的评价福氏志贺菌两种血清分型方法。方法使用传统血清分型方法和多重PCR血清分型方法对255株福氏志贺菌进行血清型分析。结果传统血清分型方法的分型率为98.4%(251/255),多重PCR血清分型方法分型率为96.1%(245/255),两种方法的分型率经卡方检验,差异无统计学意义(χ2=2.644,P>0.05)。有46株菌(18.0%,46/255)通过这两种血清分型得到的结果不一致。结论两种血清分型方法的分型率差异无统计学意义,但部分结果判断有不同。多重PCR更适用于大量样本的检测,传统血清分型方法可以与其互为补充。     

福氏2a志贺氏菌sitC插入突变体的构建、检测及微阵列分析

针对在低拷贝自杀质粒pCVD442中难以进行基因操作的缺陷,本研究将Gateway技术应用在了基因敲除前期的重组质粒构建过程。应用这一改进的系统构建了福氏2a志贺氏菌301株转铁相关基因sitC的插入突变体MTS。对突变体分别在培养基、细胞和动物实验水平进行了功能检测,并利用芯片技术进行了限铁条件下突变体和野生型菌株的表达谱比较。结果显示,添加150 µM铁螯合剂DIP（2,2’-dipyridyl）条件下,MTS生长水平明显低于野生株,补加铁离子或锰离子可使突变株生长回复到丰富培养基条件下的生长水平;在HeLa细胞和U937细胞的胞内存活增殖能力和胞间扩散能力以及豚鼠角膜结膜炎实验中,MTS没有显现出明显的毒力改变,但在HeLa细胞侵袭过程中添加65 µM的DIP,MTS的胞内存活增殖能力和Sf301相比下降了51.6%。限铁条件下的表达谱结果表明,整体上MTS对缺铁变化比Sf301更敏感,上调的基因比野生株多106个,主要涉及膜转运、氨基酸代谢和功能未分类基因,而下调基因中参与能量代谢和碳水化合物代谢的较多。缺铁条件下,已知的转铁相关基因普遍上调,且MTS中上调的基因数目及上调幅度要高于Sf301。此结果再次证实了Sit铁转运系统对志贺氏菌生长的重要性。     

福氏志贺菌CTX-M型产超广谱β-内酰胺酶的检测及耐药性

目的 产超广谱β-内酰胺酶( extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)福氏志贺菌的耐药性及其基因型.方法 K-B法检测福氏志贺菌对抗菌药物的敏感性,改良三维试验检测菌株是否产生ESBLs,ESBLs的基因型通过PCR扩增、DNA测序的方法进行.结果 148株福氏志贺菌检测出6株产ESBLs,其基因型为CTX-M-3和CTX-M-14;产ESBLs福氏志贺菌对氨苄西林、头孢噻肟、复方新诺明、四环素均耐药,对头孢西丁、亚胺培南、环丙沙星敏感.结论 应加强对福氏志贺菌的耐药性监测,合理使用抗生素,防止产ESBLs福氏志贺菌的流行和传播.     

志贺菌对HeLa细胞侵袭力的研究

通过使用噬斑形成试验、透射电镜及检测志贺菌蛋白表达等方法,研究志贺菌对Hela细胞的侵袭能力。研究发现:37℃培养条件下,胞质内出现成堆的志贺菌;30℃培养条件下,细菌主要分布在细胞外。SDS-PAGE显示,与30℃培养条件相比,在37℃培养下,志贺菌表达蛋白质的种类和数量明显增加。噬斑形成发现,12株福氏志贺菌强毒株,有9株噬斑数>1000个／ml,而2株弱毒株噬斑数则在50个／ml以下。透射电镜证实了志贺菌对细胞的黏附、侵入和释放过程。结果表明:志贺菌对细胞的侵袭能力受温度的影响;不同志贺菌流行株对细胞的侵袭力存在着差异:实验也显示,应用HeLa细胞研究志贺菌侵袭力是一种简便易行且价廉的方法。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因突变体的构建

目的：构建福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体,以进行后续ArgT功能研究。方法：根据福氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用λ-Red重组系统对argT基因进行缺失,并经PCR验证;采用定点突变的方法构建ArgT非降解株,并经SDS-PAGE验证;对野生株、argT缺失突变株和ArgT非降解突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果：构建了2457T的argT缺失突变株和ArgT非降解突变株;2种突变株初始生长均较慢,但最终和野生株状态一致;2种突变株利用甘露醇的能力都比野生株强,而利用葡萄糖的能力降低。结论：获得了福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体。     

克隆与志贺氏菌属侵袭力相关的基因

本文以柯斯质粒pJB8作载体,经体外包装构建了志贺氏菌属弗氏5大质粒(140Md)基因文库,获得重组子4000多个。用已证实与侵袭力相关的17kb基因片段作探针,从基因文库中筛选出66个相应的重组子。对其中部分重组子进行分析,表明这些重组子均包含一个大的重组质粒,它们与17kb探针杂交呈阳性反应。当用EcoR 1酶解这些重组质粒时,均产生大小相当于17kb的DNA片段,它们与17 kb探针杂交,也呈阳性反应。表明这些重组子均含与侵袭相关的基因片段。这为以后构建预防痢疾的口服活菌苗打下了基础。     

黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达

将黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOD)基因重组进大肠杆菌酵母穿梭质粒Ppic9,转化甲基营养酵母Pichia pastoris GS115,构建出GOD的高产酵母工程菌株。在酵母αFactor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,黑曲霉GOD在甲基酵母中大量表达并分泌至胞外,经甲醇诱导3～4d,发酵液中的GOD活力可达30～40u/mL。SDS-PAGE证实GOD在培养物上清中的含量显著高于其它杂蛋白,约占胞外蛋白总量的60%～70%,经Q SepharoseTMFast Flow离子交换柱一步纯化即达电泳纯。重组酵母GOD比活达426.63u/mg蛋白,是商品黑曲霉GOD的1.6倍。动力学性质分析表明,重组酵母GOD的K_m和K_cat分别为38.25mmol/L和3492.66s-1,与商品黑曲霉GOD相比,具有更高的催化效率。重组酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。     

与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的：筛选、鉴定与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用的蛋白,以进一步研究ArgT在福氏2a志贺氏菌致病过程中发挥的作用。方法：将ArgT与GST融合表达,通过体外GST沉降实验和MALDI-TOF MS技术,筛选并鉴定与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用的蛋白。结果：筛选并鉴定到与福氏2a志贺氏菌2457TArgT相互作用的蛋白OmpR。结论：OmpR与ArgT存在体外相互作用。     

Identification of a putative pathogenicity island in Shigella flexneri using subtractive hybridisation of the S. flexneri and Escherichia coli genomes

The genetic differences between the human pathogen, Shigella flexneri, and the non-pathogenic Escherichia coli were investigated in an attempt to identify pathogenicity islands (PAIs) in the S. flexneri genome. Genomic subtraction identified a large unique region of DNA which was present in S. flexneri serotype 2a but absent from E. coli K-12. This 42-kb DNA segment was localised to the S. flexneri chromosome and was found to contain a number of elements often associated with PAIs including: insertion sequence elements, bacteriophage genes, and a previously identified Shigella virulence gene (criR). These findings indicate that this region may form a new PAI in the S. flexneri genome.     

Gene expression profiling of the pH response in Shigella flexneri 2a

The pH response of Shigella flexneri 2a 301 was identified by gene expression profiling. Gene expression profiles of cells grown in pH 4.5 or 8.6 were compared with the profiles of cells grown at pH 7.0. Differential expression was observed for 307 genes: 97 were acid up-regulated, 102 were acid down-regulated, 91 were base up-regulated, and 86 were base down-regulated. Twenty-seven genes were found to be both acid and base up-regulated, and 29 genes were both acid and base down-regulated. This study showed that (1) the most pH-dependent genes regulate energy metabolism; (2) the RpoS-dependent acid-resistance system is induced, while the glutamate-dependent acid resistance system is not; (3) high pH up-regulates some virulence genes, while low pH down-regulates them, consistent with Shigella infection of the low gut; and (4) several cross-stress response genes are induced by pH changes. These results also illustrate that many unknown genes are significantly regulated under acid or basic conditions, providing researchers with important information to characterize their function.     

痢疾福氏2a asd基因的克隆及其序列分析

本文根据大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ａｓｄ基因两侧序列设计了一对引物,用全菌ＰＣＲ扩增了福氏２ａ Ｔ３２株的ａｓｄ基因及其两侧序列。对ＰＣＲ产物的初步结果表明,在ａｓｄ基因两端存在ＢａｍＨ Ｉ位点。为了防止由ＰＣＲ扩增带来的差错,我们又从福氏２ａ Ｔ３２株染色体中克隆了全长的ａｓｄ基因。序列分析了结果表明,福氏２ａＴ３２株ａｓｄ基因的序列与Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２的完全一致,全长１６８０ｂｐ,其两侧     

phyA基因新型表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

利用自行筛选、鉴定的黑曲霉F246,根据植酸酶基因(phyA)成熟肽编码序列设计引物,直接PCR扩增phyA,经酶切分析、DNA测序和氨基酸序列分析证实phyA基因克隆成功。从pMD18T-phyA克隆中获得phyA编码序列,将其与pET30a 质粒连接,构建pET30a -phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得了高效表达。重组质粒经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为50kDa,此重组蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白的36.62％,酶活性较天然植酸酶高8倍以上。因此,该phyA基因具有正常的生物学功能,对其进行深入研究,为大量获得高活性植酸酶以及开发新型微生态制剂奠定了基础。     

痢疾杆菌酸抗性系统相关基因缺失突变体的构建

依赖于谷氨酸脱羧酶的酸抗性系统对痢疾杆菌在宿主细胞内的生存和繁殖至关重要,hdeA、hdeB、yhiE和yhiF是其中几个重要的酸抗性基因。借助Red系统的重组功能,PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的抗性基因片段,电击转化痢疾杆菌2457T,对筛选到的阳性转化子再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20以去除抗性基因。结果成功的敲除了hdeA、hdeB、yhiE和yhiF等4个酸抗性系统相关基因,为深入研究痢疾杆菌酸抗性基因的调控网络奠定了基础.     

志贺氏菌福氏2a 301株ipaH4.5突变株的构建及生物学功能分析

利用λ-Red重组系统对福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因缺失突变株?ipaH4.5,利用低拷贝质粒构建ipaH4.5缺失突变株的回复突变株△ipaH4.5HF。PCR方法证实了ipaH4.5基因的缺失和回复。对野生株、突变株和回复突变株的生长代谢及细胞侵袭能力进行比较;ELISA方法检测3株菌侵袭鼠J774巨噬细胞后培养上清中炎性因子的水平。生长代谢实验表明缺失和回复ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长速度,侵袭实验表明缺失和回复ipaH4.5也不影响志贺氏菌对HeLa细胞和鼠J774巨噬细胞的侵袭能力,表明ipaH4.5基因与志贺氏菌的生长代谢和侵袭能力无关;鼠J774巨噬细胞培养上清中细胞因子水平的改变提示该基因在志贺氏菌侵入细胞后抑制宿主细胞炎症反应。     

纳豆激酶基因的克隆与表达

利用ＰＣＲ方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组ＤＮＡ 中扩增得到了纳豆激酶基因,并测定其核苷酸序列．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达．ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,表达蛋白占菌体蛋白的１５．２％ ,琼脂糖－纤维蛋白平板法测出表达产物具有溶解血栓活性．     

大肠杆菌%otsA%基因的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增了１．５ｋｂ的ｏｔｓＡ基因片段,将该片段连接到多拷贝克隆载体后转化ｏｔｓＢＡ缺失和ｏｔｓＡ缺陷的大肠杆菌菌株,使转化株重新获得ｏｔｓＡ基因功能。生长曲线表明转化株在高渗培养基中生长良好,薄层层析法（ＴＬＣ）检测海藻糖实验说明转化株细胞诱导后合成海藻糖,ｏｔｓＡ基因的克隆和表达为赋予转基因植物抗高渗、耐干旱能力提供了实验依据和材料。     

烟曲霉菌壳聚糖酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中发布的烟曲霉菌壳聚糖酶（Aspergillus fumigatus chitosanase,EC3.2.1.132）基因序列人工合成8条DNA长链及4条引物链。DNA链的设计上在不改变壳聚糖酶氨基酸组成的前提下选择大肠杆菌使用频率高的密码子。PCR拼接法扩增壳聚糖酶基因并克隆入pGEM_T easy载体进行序列分析,进一步亚克隆入表达载体pGEX_3X。重组质粒pGEX_Csn转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,亲和层析及Factor Xa酶解纯化重组Csn。所得重组壳聚糖酶具有降解壳聚糖的生物活性,其活性受温度及pH值的影响。