粪便DNA分析技术在动物生态学中的应用

粪便DNA分析是一项新发展起来的从粪便中获取动物DNA并用于相关研究的技术,该技术有助于分子生态学研究中所遇到的取样难题。通过对粪便DNA分析的研究方法、研究内容以及研究进展情况的介绍,提供了该技术不仅能用于分子生态学的许多研究领域,而且还能够提供诸如种群数量估计、领域边界划定等生态生态学信息,这是对分子生态学的重要补充。     

一种从大熊猫粪便中提取DNA的改进方法

本研究描述一个改进的方法,使从大熊猫粪便中提取DNA用于PCR扩增变得更加容易。在粪便DNA的提取过程中采用一个新的预处理方法,将粪便用预冷的丙酮洗2～3次,除去粪便中含有的大量PCR抑制物,然后用蛋白酶K裂解、酚氯仿抽提,能提取到纯度很高的DNA供PCR扩增。本实验PCR扩增了大熊猫脑源性神经营养因子(BDNF)基因和线粒体细胞色素6基因片段,并进行测序分析,证实了提取的可靠性。对比本方法和未经丙酮预处理的方法提取的DNA进行PCR扩增,前者的扩增结果明显优于后者。     

DNA分子标记技术在生态学研究中的应用

分子生物学几种常见的分子标记技术如RFLP,RAPD,微卫星法,DNA序列分析使生态学研究从宏观步入了微观领域,极大的推动了生态学的发展,对这几种分子标记技术在生态学中的应用及其进展进行了综述,并比较了这些分子生物学技术各自的优缺点.     

黑麂粪便DNA提取及其PCR检测

采集了黑麂(Muntiacus crinifrons)的新鲜粪便以及在野外自然条件下保存较长时间的粪便样品,晾干后带回实验室,提取其DNA;同时提取黑麂肌肉、皮张样品的DNA,用以对比粪便样品的提取效果。电泳检测结果显示,此方法使用实验室中常用的分子生物学试剂,可以从黑麂粪便样品中抽提到高质量的粪便DNA并克服分子粪便学研究中常见的PCR反应抑制物的影响。为其它濒危鹿科动物的非损伤性取样提供了的新途径,为其遗传结构、遗传多样性现状等研究提供了更加广阔的取材空间。     

分子粪便学及其应用——可靠性、局限性和展望

由于珍稀濒危动物的各种生存状况相当脆弱,已不允许进行破坏性的取样活动,因而长期以来,对这些动物的遗传结构及遗传多样性现状的研究一直都很薄弱。而近年来以分子粪便学为基础的粪便取样分析方法,在很大程度上解决了这一问题。传统的粪便分析方法与分子生物学技术相结合,在不干扰野生动物正常活动的情况下,可对这物种进行物种识别、性别确定、数量调查、遗传多样性、行为生态学、系统地理学、食性及疾病、巢域及分布区范围等多方面的深入研究。虽然分子粪便学由于粪便样品质量问题而具有一定的局限,从而导致其研究结果曾受到怀疑,但是该方法在近10年的发展应用中,其局限性已逐渐被克服而目趋完善,研究结果也得到了国际上的认同。因此,今后该研究方法在珍稀濒危动物行为生态学和保护生物学等研究领导中将具有很大的发展潜力,越来越多的有关珍稀濒危动物保护遗传学的研究将采用该方法进行。     

不同保存方法对川金丝猴粪便DNA提取效果的影响

目的:川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)是我国特有珍稀物种,其粪便作为一种非损伤性样品,为珍稀濒危动物的种群数量调查、遗传多样性评价、亲缘关系、系统进化等研究带来了很大便利,本研究试图建立高效、简便的粪便样品保存方法。方法:在现有珍稀濒危动物粪便样品保存方法的基础上,分别使用干燥法、冷冻法和干燥-冷冻法保存川金丝猴的粪便样品,比较了不同保存方法的DNA提取效果,以及对mtDNA控制区片段的PCR扩增成功率和微卫星基因的PCR扩增效率。结果:干燥法、冷冻法和干燥-冷冻法三种不同保存方法保存粪便1周时间后,提取的粪便DNA样本扩增mtDNA片段的成功率均为92%,微卫星基因的扩增成功率分别为79%、78%、80%;保存2个月后,mtDNA片段扩增成功率分别为80%、76%和80%,微卫星基因扩增成功率分别为65%、61%、67%;保存6个月后,mtDNA片段扩增成功率分别为56%、52%和64%,微卫星基因扩增成功率分别40%、34%、46%。因此,随着保存时间的增长,三种方法的保存效率都将明显降低,但干燥-冷冻法得到的DNA样本扩增成功率相对较高。结论:粪便样品能够为川金丝猴的遗传多样性评价等相关研究提供有效信息,干燥-冷冻法保存能够更为有效的保证DNA的提取和基因扩增效率。     

非损伤性取样法在珍稀濒危动物遗传学研究中的应用

非损伤性取样法是在不伤害珍稀濒危动物的条件下获取分析所需的DNA样本,该方法简便易行,在动物保护遗传学研究领域中得到了极其广泛的应用。就非损伤性取样的研究进展、存在问题及其应用前景进行了简要介绍。     

用于分子生态学研究的土壤微生物DNA提取方法

利用SDS高盐法和变性剂加SDS高盐法对土壤微生物总DNA进行了提取,然后通过电泳加树脂柱回收和连续2次树脂柱回收方法进行了纯化.结果表明,变性剂加SDS高盐法的DNA提取效率明显高于前者,电泳加树脂柱法的纯化效果更好.通过PCR扩增表明,经过纯化后的DNA,都可以进行16SrDNA扩增和nirK、nosZ、nifH等功能基因的扩增.因此,变性剂加SDS高盐法是一种更为高效、可靠且适合于环境微生物分子生态学研究的DNA提取方法.     

微卫星DNA在分子遗传标记研究中的应用

随着种群遗传学的发展 ,分子遗传标记特别是微卫星标记已经成为研究种群遗传的有力工具。本文就微卫星遗传标记的研究背景、技术应用以及优势与不足等方面进行了综述。     

Wild chimpanzee infant urine and saliva sampled noninvasively usable for DNA analyses

In many genetic studies on the great apes, fecal or hair samples have been used as sources of DNA. However, feces and hairs are difficult to collect from chimpanzee infants under 3 years of age. As alternative DNA sources, we investigated the efficiency of collecting urine samples from infants compared with fecal samples, as well as the validity of the DNA extracted from urine and saliva samples of well-habituated M group chimpanzees (Pan troglodytes schweinfurthii) in the Mahale Mountains National Park, Tanzania. We collected 40 urine and 3 fecal samples from 10 infants under 3 years. Compared with feces, the urine samples were relatively easy to collect. The saliva of infants, which remained on the twigs sucked by them, was collected using cotton swabs. The average amounts of DNA extracted from the 40 urine and 6 saliva samples were 3,920 and 458 pg/μl, respectively. The rate of positive PCR was low and the allelic dropout rate was high when using less than 25 pg of template DNA in the PCR mixtures. Based on the amounts of DNA, 50% of the urine samples and 100% of the saliva samples were judged usable for accurate microsatellite genotyping. For infant chimpanzees in particular, collecting urine and saliva as an alternative to fecal and hair samples can reduce the effort invested in collection in the field.     

Examining genetic diversity and identifying polymorphic microsatellite markers for noninvasive genetic sampling of the Indochinese leopard (Panthera pardus delacouri)

Indochinese leopard (Panthera pardus delacouri) is one of the least-known leopard subspecies and occurs in mainland South-east Asia. Given the elusive nature, low density, and large movement ranges of leopard, noninvasive genetic sampling may be an effective approach for studying this subspecies. We examined the potential for 18 microsatellite loci to allow reliable identification of noninvasively collected leopard samples based on feces collected in eastern Cambodia. The expected heterozygosity calculated from 5 to 7 leopard individuals ranged from 0.49 to 0.91 with an average of 0.73, showing a high level of genetic diversity. Only the five most informative loci decreased the probability of identity for siblings (P_ID-sib) to less than 0.01, which would be sufficient for abundance estimation. A further increase of the number of loci up to 8–10 decreased the P_ID-sib to the level of 0.001–0.0001, which may be useful in cases of parentage analysis or forensic analysis. The microsatellite markers shown in the present study achieved a sufficient level of accuracy for individual identification, and thus, will be useful for examining abundance, genetic structure, or relatedness of the Indochinese leopard in future.     

基于非损伤取样法的林麝微卫星遗传多样性分析

林麝（Moschusberezovskii）为我国一级重点保护野生动物,为了保护野生林麝种群、满足中医药等行业对天然麝香的需求,我国从20世纪50年代开始人工饲养林麝。维持高的遗传多样性是实现饲养林麝种群可持续增长并放归野外的关键因素。本研究旨在筛选可用于粪便DNA扩增的林麝四碱基微卫星位点,并评估陕西凤县2个饲养林麝种群的遗传多样性。通过搜集文献,共获得25个林麝四碱基微卫星位点,其中19个可从粪便DNA中稳定扩增,且基因分型峰型较好,能用于后续分析,与前人研究相比增加了13个粪便DNA微卫星位点。利用19个微卫星位点,对陕西凤县富民和海兴2个饲养林麝种群共计95只林麝进行遗传多样性分析,其中7个位点多态信息含量超过0.5,为高多态性位点,10个位点符合哈迪-温伯格平衡（P> 0.05）。本研究中的95只林麝共存在99个等位基因,有效等位基因总数为43.880 5,平均Shannon’s信息指数为0.930 6,平均多态信息含量为0.428 3,表明陕西饲养林麝种群具有较高的遗传多样性。平均观测杂合度为0.449 4,平均期望杂合度为0.467 5,观测杂合度低于期望杂合度,种群存在近交的趋势。富民麝场饲养林麝遗传多样性高于海兴麝场,2个种群的遗传分化较小,有较大的基因流,所有林麝个体共来源于4个基因簇,富民麝场的林麝主要来自于1和2基因簇,海兴麝场的林麝主要来自于3和4基因簇。     

非损伤性取样样品中富集宿主DNA的研究进展

非损伤性取样被广泛应用在动物保护遗传学、分子生态学和分子进化等研究领域.随着基因组测序技术的发展和基因组学时代的到来,如何从非损伤性取样样品中获取能够用于进行基因组测序的高质量DNA是研究者面临的难题.本文总结和比较了非损伤性取样中最常用的粪便样品和考古材料或博物馆标本两类样品中富集宿主DNA的方法及应用,以期为非损伤...     

贮存温度和时间对大熊猫粪便样品皮质醇浓度的影响

通过非损伤性取样比如粪便样品监测野生动物受胁迫的水平已成为一个重要的手段,然而针对从野外采集的样品,其运输和贮存温度条件是否干扰分析结果,尚未有过报道。为评估不同贮存温度和天数对野生动物粪便样品中皮质醇浓度的影响,我们将大熊猫的新鲜粪便置于3 种模拟条件(0℃ 、10℃ 和22℃ ),并进行连续6 d的检测分析。结果表明,贮存天数对粪样中皮质醇浓度有显著影响(F _5,107 = 7.501,P = 0.001),但温度则无显著影响(F _2,107 = 1.094,P = 0.366)。粪样在0℃ 、10℃ 和22℃ 条件下贮存6 d,皮质醇浓度与贮存前的基准值之间均不存在显著差异(0℃ :F _6,41 = 1.274,P = 0.290;10℃ :F _6,41 = 2.027,P = 0.084;22℃ :F _6,41 =1.009, P = 0.434)。结果提示在室温条件下短期运输和贮存(不超过6 d),不会引起大熊猫粪便样品中皮质醇浓度的显著变化。该结果对于野外所采集的粪便样品运输和贮存具有一定的指导意义。     

基于粪便DNA 的藏狐微卫星位点筛选及个体识别

藏狐是我国青藏高原东部多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫最主要的野生动物终末宿主。棘球绦虫会导致一类称为棘球绦虫病的致死性人兽共患疾病,青藏高原东部牧区是该病重要的流行区。因此作为终末宿主,评估藏狐种群的棘球绦虫感染率对于该病的流行病学研究意义明显。而要获取这方面信息,首先必须了解藏狐的种群数量。为此,我们基于非损伤取样的原则,使用藏狐新鲜粪便作为研究材料,从已发布的藏狐及近缘种的48个微卫星位点中筛选了11 个用于藏狐粪便DNA 多态性分析。对2011 -2012 年7 -8 月间收集的128 份有效藏狐粪便样品(2011 年68 份,2012 年60 份)进行特异性PCR 扩增,并用琼脂糖凝胶电泳和荧光引物标记法进行基因分型,根据各位点的等位基因频率计算出各位点的基因型数(N),期望杂合度(He )、观测杂合度(Ho)、多态信息含量(PIC)以及不同个体基因型相同概率值(PI)。结果发现,各位点N 介于4 - 7,H e为0.66 - 0. 80,H o为0.17 -0.68,PIC 为0.5496 - 0.7623。11 个位点的累积PI 值满足个体识别的需要(PIbiased = 1. 283 × 10 ^{- 11} ;PIsi bs =7.572 × 10 ^{- 5} )。但是,由于粪便DNA 质量差异较大,不同位点的扩增成功率差异较大(0.176 - 0. 926)。我们发现,按照扩增成功率由高到低排列,前6 个微卫星位点(P03,CXX172,CPH6,CPH8,P01i,P08)的扩增成功率均超过0.6,且累积PI 值小于0.004 (PIbiased =2.775 × 10 ^{- 7} ;PIsibs = 3. 606 ×10 ^{- 3} ),表明这6 个位点可以对藏狐进行个体识别。因此,针对本研究的数据,制定了如下的个体识别原则: (1)只有粪便DNA 至少成功扩增出前6 个微卫星位点的样品可以进入下一步分析; (2)所有位点的信息均相同的两个样品被认为是来自同一个体;(3)保险起见,如果仅有一对位点信息不相等,此两个样品依然被判定来自同一个体。在此基础上,我们从2011 年样品中识别出30 个藏狐个体,从2012 年样品中识别出21 个个体。     

东方白鹳粪便总DNA五种提取方法的比较

本研究比较东方白鹳(Ciconia boyciana)粪便总DNA的5种提取方法,旨在为后续物种性别鉴定和DNA条形码鉴定提供合适的方法.采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)、十二烷基磺酸钠裂解法(SDS法)、Tiangen试剂盒法、Qiagen试剂盒法和异硫氰酸胍法(GuSCN法)对取自天津动物园的东方白鹳新鲜粪...