杜氏盐藻促生菌株的分离与鉴定

拟通过探究藻际微生物对微藻生长及代谢产物积累的影响,筛选出促进微藻生长的促生菌株。以杜氏盐藻(Dunaliella salina)Ds-SXYC-2为试材,分离鉴定盐藻藻际环境中的共生菌株,进一步构建藻菌(1∶1)共培养体系、测试盐藻生长及代谢产物积累等表型。结果显示,从杜氏盐藻藻际环境分离获得5株共生菌株,经16S rDNA分子鉴定,属于3个菌属。菌株B1与B2为涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia),菌株B3与B4为盐单胞菌(Halomonas),菌株B5为海杆菌(Marinobacter)。5株共生菌株对杜氏盐藻的生长均有促进作用,菌株B3能显著促进杜氏盐藻生长及代谢产物的积累。共培养15 d后,杜氏盐藻生物量达到2.3 g/L,比对照组增加了28.9%,叶绿素a的含量达到4.61 mg/L,比对照组增加了36.3%,β-胡萝卜素比对照组提高了56.4%。盐藻多糖、蛋白质、总脂含量分别比对照组增加了34.8%、71.2%和37.6%。菌株B3盐单胞菌可以作为促进杜氏盐藻生长及代谢产物累积的优势菌株,进一步构建共培养体系可应用于杜氏盐藻的商业生产。     

杜氏盐藻的耐盐机制研究进展和基因工程研究的展望

概述了杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的耐盐机制和基因工程的研究进展。盐藻的耐盐机制十分复杂 ,短时间内通过细胞体积的改变来调节渗透压平衡 ,之后通过甘油的合成与转化恢复细胞正常形态和大小。渗透调节过程中 ,还涉及到蛋白质的合成。cDNA文库和基因组文库已经建立 ;几种基因已被克隆 ,如碳酸酐酶基因和硝酸还原酶基因等 ;GUS(β_葡糖苷酸酶 )基因已成功地转入盐藻细胞内。另外 ,对盐藻的基因工程作了简单的展望     

盐生杜氏藻和青岛大扁藻的超低温保存

采用两步法冷冻技术超低浊保存盐生杜氏藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎｕ（Ｄｕｎａｌ）Ｔｅｏｄ．）和青岛大扁藻（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｈｅｌｇｏｌａｎｄｉｃａ Ｋｙｌｉｎ ｖａｒ．ｔｓｉｇｔａｏｅｎｓｉｓ）。当二甲基亚砚（ＤＭＳＯ）浓度分别为５％和２０％,平衡时间均为ｍｉｎ,预冻温度及保持时间分别为－４０℃,６０ｍｉｎ和－３０℃,３０ｍｉｎ;化冻后分别在０℃和到温下采用慢速稀释法去除ＤＭＳＯ时,     

杜氏盐藻的耐盐机制研究进展和基因工程研究的展望

概述了杜氏盐藻（Dunaliella salina）的耐盐机制和基因工程的研究进展。盐藻的耐盐机制十分复杂,短时间内通过细胞体积的改变来调节渗透压平衡,之后通过甘油的合成与转化恢复细胞正常形态和大小。渗透调节过程中,还涉及到蛋白质的合成。cDNA文库和基因组文库已经建立;几种基因已被克隆,如碳酸酐酶基因和硝酸还原酶基因等;GUS（β_葡糖苷酸酶）基因已成功地转入盐藻细胞内。另外,对盐藻的基因工程作了简单的展望。     

杜氏盐藻基因工程选择标记的研究

研究了杜氏盐藻对链霉素,卡那霉素,潮霉素,G418和氯霉素5种常用抗生素的敏感性。结果表明,经4周培养,盐灌对链霉素,卡那霉素,潮霉素和G418不敏感,浓度高达600ug/ml时,也不能抑制盐藻生长,对氯霉素很敏感,60ug/ml即可完全抑制固体和液体培养中盐藻的生长,氯霉素合作为盐藻基因工程的筛选抗生素,CAT基因在其阳性筛选标记基因。     

杜氏盐藻细胞质膜氧化还原系统

杜氏盐藻细胞质膜具的氧化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ,还原Ｆｅ（ＣＮ）＾３－６和Ｏ２的氧化还原系统。当Ｆｅ（ＣＮ）＾３－６浓度为０．６ｍｍｏｌ／Ｌ,氧化ＮＡＤＨ的Ｋｍ为９６μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１５９ｎｍｏｌ１０＾－８ｃｅｌｌｓｍｉｎ＾－１,最适ｐＨ为８．５。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００可促进ＮＡＤＨ和Ｆｅ（ＣＮ）＾３－６的氧化还原活性。ＮＡＤＨ能促进藻细胞的氧吸收,最适ｐＨ为８．５。在无外源电子供体存在时,细胞质     

杜氏盐藻电击转化方法的系统优化

本研究系统分析了盐藻生长状态、电击条件、电击缓冲液成分和质粒浓度等条件对电击转化效率的影响。实验结果表明:正常接种后培养7d对数生长中期的盐藻细胞,在25μF、0.8kV的电击条件下加入终浓度为10μg/mL的质粒可使盐藻电击转化效率达到1.85‰;电击缓冲液中加入0.4mol/L的甘油可使转化效率显著提高至2.03‰(P<0.05)。在上述优化电击体系下,运用3种不同质粒分别转化盐藻细胞后获得的转化效率无显著差异。通过对电击转化中相关因素的优化,本研究建立了一种适用于杜氏盐藻的高效稳定的电击转化体系,为杜氏盐藻的转基因研究提供有效方法。     

静态荧光光谱法研究杜氏盐藻的生长规律

测量了杜氏盐藻不同生长期的静态荧光光谱,得出了杜氏盐藻生长规律曲线。通过与传统的分光光度计法和血球计数板法研究盐藻生长规律的比较发现,该方法反映的是活盐藻细胞浓度的变化情况,更能反映盐藻实际生长规律;不仅操作简便,灵敏度高,而且可以实现远距离非接触测量。     

甘油对杜氏盐藻电击转化的影响

通过在HEPES电击缓冲液中添加不同浓度的甘油,讨论了甘油对电转前细胞存活率的影响;通过在盐藻培养基中添加不同浓度的甘油,讨论了甘油对盐藻细胞生长的影响;使用含有不同浓度甘油的HEPES缓冲液介导质粒载体转入盐藻细胞,比较了甘油对于转化率的影响。实验结果表明,在电击缓冲液中添加0.5mol/L甘油能有效提高细胞存活率,促进转化细胞恢复生长,从而获得最佳转化效果。因此,0.5mol/L甘油可作为杜氏盐藻电击转化过程中一种良好的稳渗剂。     

杜仲对铜胁迫后杜氏盐藻恢复速率的影响

本研究通过检测不同浓度的杜仲药液对铜胁迫下的盐藻细胞数和叶绿素含量,来探讨杜仲对铜胁迫后杜氏盐藻恢复速率的影响。结果表明,适当浓度的杜仲药液会加快盐藻的恢复速率,其中5mg/ml的药液作用最为明显。     

外源ble基因在杜氏盐藻中的瞬时表达

利用电击法将带有ble基因的pSP124S转入杜氏盐藻细胞内进行瞬时表达,研究了外源基因在盐藻内的存留及表达情况,确定了合适的电击转化条件,发现利用电击法可以使大量的质粒导入盐藻细胞,质粒在细胞中逐渐降解但至少96h内可以检测得到,外源启动子能够使ble基因有效转录,转录至少可以持续72h,ble基因能够在盐藻细胞中正确翻译,可以作为盐藻遗传转化研究的筛选标记。     

蛋白质修饰剂对盐藻光合作用的影响

经蛋白质化学修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、丁二酮（BTO）和对-氯汞苯甲酸（ρCMB）处理的盐藻细胞光合速率下降,0.17mmol/L的ρCMB和0.07mmol／L的NBS可完全抑制光合放氧。在藻细胞的可见光（400—700nm）区吸收光谱中,三种修饰剂都降低了整个波段的吸收。在两个主要吸收峰中,678nm吸收值的下降略大于436nm的下降。在紫外光谱区（200—300nm）,ρCMB和BTD使原吸收峰（203nm）值明显降低,NBS处理使吸收峰红移13nm。细胞胀破后紫外光谱出现更显著变化,峰位移至223nm（BTD）、250nm（NBS）,或至214—237nm而呈一个宽的平台（ρCMB）。紫外差示吸收光谱显示210nm的负峰;随修饰剂浓度增大,负差示峰可移到225nm（NBS）、245．5nm（ρCMB）和212nm（BTD）。     

外源ble基因在杜氏盐藻中的瞬时表达

利用电击法将带有ble基因的pSP124S转入杜氏盐藻细胞内进行瞬时表达．研究了外源基因在盐藻内的存留及表达情况,确定了合适的电击转化条件,发现利用电击法可以使大量的质粒导入盐藻细胞,质粒在细胞中逐渐降解但至少96h内可以检测得到。外源启动子能够使ble基因有效转录,转录至少可以持续72h,ble基因能够在盐藻细胞中正确翻译,可以作为盐藻遗传转化研究的筛选标记。     

高渗震动对杜氏盐藻细胞跨膜K+运输的影响

杜氏盐藻细胞吸收K 的Km为 2 .86mmol/L ,Vmax为 1 .39μmol/1 0 8cells .h。钒酸钠和DES、CCCP、Li 抑制藻细胞对K 的吸收。高渗震动促进藻细胞H 的分泌 ,降低K 的吸收速率 ,CCCP和Li 减弱了高渗震动对藻细胞K 吸收的抑制。高渗震动对藻细胞K 分泌有轻微的抑制作用。     

盐生杜氏藻质膜ATPase及其对高渗震动的反应

用水溶性多聚物 ( dextran T5 0 0 PEG 335 0 )两相法制备盐生杜氏藻细胞质膜 ,经检测质膜纯度较高 ,原位膜约占 78%。质膜 ATPase的动力学常数 Km 和 Vmax分别为0 5 8mmol L和 4 3 5 9μmol Pi ( mg protein· h) ;最适 p H值是 7 5。质膜 ATPase的活性随Mg Cl2 和 Ca Cl2 浓度的升高而增加 ,但较高浓度的 Mg Cl2 和 Ca Cl2 有轻微的抑制作用 ;KCl促进质膜 ATPase的活性 ,在 1 0 0 mmol L时达到最大 ,高于 1 0 0 mmol L时抑制效应显著。钒酸钠、DES、DCCD和 NEM明显地抑制质膜 ATPase的活性 ;而 Na N3、Na NO3、Na Mo O4和KCN对质膜 ATPase的活性影响不大。高渗震动刺激了质膜 ATPase的活性。     

ANALYSIS OF THE EXPRESSION OF GENES FOR P-TYPE ATPASE IN THE HALOTOLERANT ALGA DUNALIELLA SALINA (CHLOROPHYCEAE)1

A partial complementary DNA (cDNA) (DSA8) for a P-type ATPase was obtained from the halotolerant alga Dunaliella salina (Dunal) Teod. (Chlorophyceae). The cDNA exhibited greater than 90% homology to the cDNA for a H⁺-ATPase in D. bioculata Butcher. The expression of the gene that corresponded to DSA8 was decreased strongly by increases in NaCl concentration. The expression of a gene that corresponded to another ATPase (DSA1; possibly for a Ca²⁺-ATPase) from D. salina did not show the same decrease as did the DSA8. However, increased osmotic pressure due to glycerol resulted in the same decrease in the DSA8 gene. Under salt or osmotic stress, the activity of a H⁺-ATPase from microsomes of this alga also decreased. We suggest that expression of the gene for the plasma membrane H⁺-ATPase of D. salina is regulated by osmotic pressure rather than by the concentration of NaCl.     

LOW-TEMPERATURE-INDUCED SYNTHESIS OF α-CAROTENE IN THE MICROALGA DUNALIELLA SALINA (CHLOROPHYTA)

The microalga Dunaliella salina (Teo.) is well known as an accumulator of β-carotene (β,β-carotene) when subjected to growth-limiting conditions (e.g. exposure to high irradiances). In addition, the carotenoid α-carotene (β,ε-carotene) may also be synthesized and subsequently accumulated by this alga under specific growth conditions. The main factor in stimulating the synthesis of this carotene was determined to be exposure to lower than optimum temperatures for algal growth. A 7.5-fold increase in the levels of α-carotene was observed when the temperature was decreased from 34 to 17° C, whilst levels of β-carotene were unaltered. The accumulation of α-carotene was unaffected by irradiance, although its isomeric composition was greatly altered by light levels. The proportion of 9- cis α-carotene increased from 15% to 45% of total α-carotene when the irradiance was decreased from 260 to 50 μmol·m⁻²·s⁻¹. Exposure to higher irradiances had little influence on the isomeric composition of this carotenoid. A reduction in growth temperature did not influence the isomeric composition of α-carotene. Nutrient status (nitrogen and phosphate) had no effect on either the content or isomeric composition of α-carotene accumulated by D. salina.     

强光诱导叶片和盐藻在505nm的差示吸收和叶绿素荧光的变化

用分光光度计直接测定几种植物叶圆片和单细胞盐藻照强光（1500μmolm-2s-1）前后在505nm（玉米黄质吸收峰）的光一暗差示吸收变化。短期照光的时问进程中,芦荟（Aloevera）、芒果（Mangiferaindica）、白菜（BrassicaChinensiS）和苦卖菜（SonchusOleraceus）的AA505持续增高,达最大值后有所下降。加入抗坏血酸能刺激光下AA505增大。光诱导的AA505可在暗下消失。单细胞盐藻M50,受光诱导的变化趋势与高等植物叶片相似。研究表明,强光下植物体内出现活跃的与紫黄质去环氧化反应有关的光保护机制的运行,其状况可直接用M505作为检测指标。与白光相比,红色强光只有照射5min时才引·起盐藻AA505上升,在5-90min照光过程中对Fv／Fm的影响比白光小,对AA540的影响比白光大,但两种光反对光合色素的影响没有差异。     

杜氏盐藻随机MAR文库的构建

核基质附着区(Matrixattachmentregion,MAR)是一段与核基质结合的DNA序列。为分离杜氏盐藻核基质附着区,我们首次构建了杜氏盐藻MAR文库。首先用0.5%TritonX-100裂解细胞,经30%和70%Percoll不连续梯度离心分离盐藻细胞核,再用二碘水杨酸锂(lithiumdiiodosalicy-late,LIS)去除组蛋白和限制酶消化除去结合松弛的DNA片段,最后通过蛋白酶K消化和乙醇沉淀提取盐藻核基质DNA。采用4种限制酶酶切,T_4DNA连接酶连至用相应限制酶酶切的pUC18载体上,转化E.coliJM109感受态细胞,挑选阳性克隆,构建MAR文库。部分测序分析表明,克隆的DNA片段具有明显的MAR特征。为进一步研究MAR对基因表达的调控作用及其作用机制提供了基础。