群特异性蓝舌病病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备群特异性抗蓝舌病病毒（BTV）单克隆抗体,并对其特性进行鉴定,为建立检测BTV抗原及抗体的ELISA方法奠定基础。方法：用纯化的BTV颗粒为免疫抗原免疫BALB/c鼠,以大肠杆菌表达的VP7蛋白作为筛选抗原,用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株;选取抗体效价最高的一株制备BTV单克隆抗体,以该抗体为捕获抗体与8种不同血清型BTV进行ELISA反应,结果与细胞病变反应进行比对;以该抗体为竞争抗体,与12种不同血清型绵羊BTV抗血清进行竞争ELISA反应,并将结果与参比c-ELISA试剂盒结果进行比对。结果：筛选出5株稳定分泌BTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并选其中一株（3E2）制备了高纯度的单克隆抗体;该单抗用于检测不同血清型BTV,与细胞病变反应结果完全相符;用于检测不同血清型绵羊BTV抗血清,其结果与参比c-ELISA试剂盒符合率为100%,与鹿流行性出血热病毒抗原和抗体均无交叉反应。结论：制备的BTV单克隆抗体具有良好的群特异性,可用于检测不同血清型BTV抗原及BTV抗体。     

蓝舌病病毒4型特异性竞争ELISA检测方法的建立

旨在建立蓝舌病病毒4型(BTV-4)特异性抗体ELISA检测方法,为蓝舌病的免疫学诊断提供新的技术。利用制备的两株抗4型BTV VP2蛋白的单克隆抗体4A-1G7和4B-1B6,建立BTV-4特异性竞争ELISA抗体检测方法。利用该方法同时对50份羊和牛BTV阴性血清进行检测,分别确定两种方法阻断率临界值为49%和40%。利用标准阳性血清检测的试验结果表明,该方法的敏感性、特异性和重复性符合OIE通用标准。同时,4A-1G7和4B-1B6两种竞争ELISA方法联合作用,可以检测感染4、18和20型BTV的血清。研究结果为建立以上各型BTV的检测方法提供了基础。     

干扰素刺激基因IFIT1抑制蓝舌病病毒的复制

为了研究干扰素刺激基因1(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,IFIT1)在蓝舌病病毒1型（Bluetongue virus serotype 1,BTV1）感染复制过程中的作用,首先利用实时定量PCR检测到BTV1感染绵羊睾丸细胞后IFIT1基因的转录水平明显升高,利用RT-PCR方法扩增获得羊IFIT1基因,测序后进行生物信息学分析,将其克隆到质粒载体pcDNA3.1/（+）上,构建重组表达质粒pcDNA3.1-OV-IFIT1,将其转染BHK-21细胞,观察到IFIT1基因在细胞内的成功表达,然后利用BTV1感染质粒pcDNA3.1-OV-IFIT1转染的细胞,从病毒的mRNA转录、蛋白表达和病毒滴度的变化评价IFIT1对BTV1复制的影响。结果显示,IFIT1在细胞中的过表达可显著抑制BTV1复制,相反,敲低IFIT1的表达可促进BTV1的复制。本研究首次报道了干扰素刺激基因IFIT1在BTV1感染复制过程中的作用,这将有助于揭示BTV1和宿主细胞IFIT1的相互作用机制,同时也为抗病毒药物研发...     

库蠓源蓝舌病病毒1型的分离和初步鉴定

为监测云南边境地区虫媒库蠓蓝舌病病毒携带情况,本研究对2013年-2017年从云南6个口岸及周边地区采集到的约5 400只库蠓样本,分180组。采用荧光定量RT-PCR检测、鸡胚和细胞分离、目的基因克隆测序分析和间接免疫荧光试验等进行病毒分离与鉴定。结果显示:采集库蠓样本中有20组检出蓝舌病病毒核酸,检出率为11.11%(20/180);接种后有1份样本能导致鸡胚胚体充血出血和死亡以及BHK-21细胞呈现明显的细胞病变;RT-PCR能从感染细胞样本中扩增出蓝舌病病毒VP7基因特异性片段,且该片段序列与国外BTV-1毒株相应序列的相似性达95%~99%;间接免疫荧光试验显示分离病毒能与BTV-1抗体发生特异性结合。结果表明,云南边境地区库蠓携带有蓝舌病病毒,且为BTV-1,因此应加强对云南边境地区蓝舌病的预防与控制。     

中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

[背景]蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,我国存在12种血清型BTV (BTV-l、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)的流行.[目的]建立12种血清型BTV的RT-qPCR定型方法,为BTV的诊断与流行病学研究提供技术保障....     

十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT-PCR定型方法的建立

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估.实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL(BTV-8)至57拷贝/μL(BTV-14)之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性.反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92％至1.96％之间,组间Ct值的变异系数在0.26％至1.62％之间.对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT-PCR可有效检测含50个PFU(噬斑形成单位)的BTV血液样本.本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT-PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断.     

小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。     

检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法

建立了检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法。小牛血清与胎牛血清的培养效果无差异。7株不同来源的出血热病毒均能在E6细胞上形成空斑。接种的病毒浓度与形成的空斑数呈直线关系。用空斑法测得的病毒滴度稍低于荧光TCIE50滴定法。空斑减少中和试验的敏感性较荧光中和试验高30倍左右。同时还初步表明了本方法可用于流行性出血热病毒的抗原性分析。     

用间接免疫荧光法检测流行性出血热病人尿中特异性抗体的研究

用间接免疫荧光法检测110例不同病程、病期及病型的流行性出血热病人尿中及血清中特异性抗体。尿中IgM型抗体阳性率为62.7％。尿中IgG型抗体阳性率91.8％与血清IgG型者90.9％相似,而总阳性率(IgG或IgM有一项以上阳性者的总检出率)99.1％则高于血清IgG者。20例其它疾病及10例正常人尿抗体均为阴性。结果表明尿抗体检查法是特异且可靠的,它比血清学方法简便、灵敏、为临床诊断可早期快速得出结果,不用采血有利于病人。IgM型抗体阳性率受病程、病期、病型及尿蛋白量的影响较明显。     

蓝舌病病毒基因节段2与6的重配导致病毒血清型与增殖特性的改变

[背景]蓝舌病病毒(Bluetongue Virus,BTV)是一种侵染反刍动物的虫媒病毒,基因重配可引起病毒的快速变异.[目的]通过我国强致病性BTV-16型毒株与弱致病性BTV-4型毒株间Seg-2与Seg-6基因节段的重配,探讨病毒基因重配与表型变异之间的关系.[方法]采用全长cDNA扩增与高通量测序获取BTV-...     

用反向被动血凝及血凝抑制方法检测流行性出血热病毒抗原和抗体

本文建立了检测流行性出血热病毒(EHFV)液体抗原及抗体的反向被动血凝(RPHA)和血凝抑制(RPHI)方法,RPHA检测EHFV抗原的敏感性与ELISA相近;RPHI检测EHFV抗体与IFA的符合率为97.3％,敏感性略低。     

用生物素—亲和素酶染色法检测流行性出血热病人血清抗体

目前,生物素—亲和素系统在微生物方面的应用主要局限于ELISA法。我们用生物素一亲和素酶染色法(BAPS)检测流行性出血热(EHF)患者血清抗体,获得满意结果。 用BAPS法检测10份EHF患者的抗体及滴度,用兔抗76-118血清作为已知阳性对照,同时以20份非EHF患者血清为阴性对照。首先分别将感染了流行性出血热病毒陈株、A9株、R22株的Verc-E6细胞固定于含12个憎水漆圈的载玻片上,于此三种抗原片上分别滴加上述待检血清,37℃湿盒30分钟,PBS-     

应用免疫粘附血凝技术检测流行性出血热病毒抗原和抗体的试验研究

本文对免疫粘附血凝(IAHA)技术进行了改进并用于检测流行性出血热病毒搞原和血清效价。比较了不同毒株在Vero-E_6细胞内抗原滴度,表明A_9株的滴度最高达1:64,以IAHA法对出血热病人9份血清,3份恢复期血清和家兔免疫血清6份进行了效价测定。并同时用免疫荧光(IFA)法进行比较,结果抗体阳性率二种方法一致,但前者的抗体滴度和增长倍数较后者高2-64倍,以上结果表明IAHA法可代替IFA法用于出血热病人或感染动物的抗体检测。     

双抗体夹心ELISA法检测肾综合征出血热汉滩病毒糖膜蛋白

用双抗体夹心ELISA法检测肾综合征出血热（HFRS）汉滩病毒LRI株糖膜蛋白（GP）,并用SDS－PAGE电泳对ELISA检测结果进行验证,实验结果显示,双抗体夹心ELISA法特异性强,重复性好,简便易行,是HTN病毒糖膜蛋白较为理想的检测方法,对HFRS疫苗的生产和质量控制有重要意义。     

酶标SPA玻片法快速检测流行性出血热血清抗体的研究

本文介绍了 HRP-SPA 玻片染色法检测病人和动物血清抗体的方法,并与酶标抗体和 IF 法作了比较。结果提示 EHF病人在发病3天直至病后16年均可检出抗EHF 的 IgG 抗体,故这三种方法均可用于对 EHF 的早期、快速及追溯诊断和流行病学调查。这三种方法均较快速,并具有较好的特异性,但 HRP-SPA 法较后两种方法敏感并具有更多的优点,主要是便于在基层推广使用。     

胶体金法与TPPA法检测梅毒特异性抗体的对比研究

目的 :探讨梅毒螺旋体特异性抗体胶体金法 (TPAb)在临床工作中的应用。方法 :以梅毒累旋体明胶凝集试验 (TPPA)为“金标准” ,同时用TPAb法检测梅毒高危人群的血清。结果 :两种方法经 χ2 检验P >0 0 5 ,差异没有显著性 ,Kappa值为 0 86 ,TPAb法其敏感性 88 9% ,特异性 97 8% ,准确性 93%。结论 :TPAb法可推荐用于血清学梅毒特异性抗体检查 ,有助于临床梅毒的快速诊断     

应用蚀斑法和细胞病变法检测乙型脑炎减毒活疫苗病毒的比较

应用蚀斑法（ＰＦＵ）和细胞病变法（ＣＰＥ）检测乙型脑炎减毒活疫苗的病毒滴度,比较结果：①两种方法同时对同一批乙脑活疫苗进行１０次测定,ＣＰＥ滴定结果比ＰＦＵ滴定高１０Ｌｏｇ值,标准差Ｓ＝０１９６,变异系数ＣＶ％＝１９２％;②对不同批乙脑活疫苗检测,仍以ＣＰＥ法高于ＰＦＵ,差值Ｘ＝１２０,标准差Ｓ＝０３１,变异系数ＣＶ％＝２５６％;③ＰＦＵ法对同一批疫苗滴定３０次,乙脑活疫苗参考品滴定１８次,变异系数仅为１４８％和１２７％。结果表明,虽然ＣＰＥ法用于滴定乙脑活疫苗的滴度高于ＰＦＵ法,但蚀斑法系统误差小,重复性好,结果客观可靠,可避免ＣＰＥ法中由于细胞退化和工作人员主观判定造成的系统误差。     

用PAPO法对流行性乙型脑炎急性期患者外周血白细胞中的乙脑病毒相关抗原定位检测

1991年7－8月在流行性乙型脑炎收治中,用PAP法对急性期患者外周血白细胞进行乙脑病毒相关抗在的检测。结果：总检出率为41．2％（24／51）,各型检出率：轻型25．0％（2／8）、型44．8％913／29）、重型42．9％（6／14）,三型间检出率无差异（P＜0．05）。检出病程最早3天,最迟10天。三种白细胞检出率依次为：中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞,可在三种或二种细胞中同时检出,亦有仅见于一种细胞之中。并就检出意义进行了讨论。