肝硬化患者的免疫功能障碍与血清壳多糖酶3样蛋白1表达的关系

摘要 目的：探究肝硬化患者的免疫功能障碍与血清壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）表达关系。方法：招募2018年2月至2020年8月在我院就诊的160例肝硬化患者。通过Child-Pugh评分对肝病的严重程度进行分组,轻度组（n=73）和重度组（n=87）。在本院健康检查中心招募60例年龄相仿且无任何明显疾病或感染的人员作为对照组。并检测CHI3L1蛋白表达、CHI3L1浓度、MR浓度、CD3⁺T、CD25⁺T和CD69⁺T水平以及血浆细胞因子的浓度。结果：对照组较轻度和重度组AST、ALT浓度升高,且轻度组较重度组升高（P<0.05）。Cr血清浓度各组比较无差异（P>0.05）。轻度组中93.15 %患者为Child-Pugh A,重度组中全部为Child-Pugh B/A。重度组较轻度组肝硬化程度严重（P<0.05）。重度组和轻度组较对照组CHI3L1蛋白表达升高,重度组较轻度组升高（P<0.05）。重度组和轻度组血清CHI3L1水平较对照组升高（P<0.05）,重度组较轻度组升高（P<0.05）。重度组和轻度组血清CD163和甘露糖受体（MR）水平较对照组升高（P<0.05）,重度组较轻度组升高（P<0.05）。重度组和轻度组血清CD3⁺T、CD25⁺T和CD69⁺T水平较对照组升高,重度组血清较轻度组升高（P<0.05）。重度组和轻度组白细胞介素（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素（IFN-γ）浓度较对照组升高,重度组较轻度组升高（P<0.05）。Logistic回归分析,提示患者血清CHI3L1、MR、CD3⁺T、CD25⁺T、CD69⁺T与患者肝硬化程度相关（P<0.05）。结论：肝硬化患者中血清CHI3L1与肝硬化严重程度呈正相关,CHI3L1促进T细胞活化、增殖和炎性细胞因子的分泌,这导致加重了免疫介导的肝损伤和纤维化的发展。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1^M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组（P〈0.05）,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞（P〈0.05）。结论成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1 M26I的NIH3T3细胞。DJ-1 M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡。     

抗凋亡蛋白Mcl-1及其抑制剂的研究进展

骨髓细胞白血病蛋白Mcl-1是Bcl-2家族蛋白中重要的抗凋亡蛋白成员,其在多种恶性肿瘤(急性细胞性白血病、多发性骨髓瘤等)中都具有高表达的特点,导致肿瘤细胞对传统化疗药物及Bcl-2抑制剂产生耐药性。Mcl-1作为抗肿瘤药物研发的重要靶点正日益受到相关研究人员的关注,其中Mcl-1新型抑制剂以及联合抑制剂的研究取得了较大进展。本文将对Mcl-1蛋白结构和功能以及相关抑制剂的研究做更深入的分析和总结。     

异染色质相关蛋白1在哺乳动物生殖中作用的研究进展

异染色质是指在细胞周期中维持凝缩状态的染色质,具有维持染色体稳定性和调节真核细胞基因表达的作用。异染色质相关蛋白1(heterochromatin associated protein1,HP1)是异染色质的特征性蛋白,进化高度保守,在哺乳动物有三种亚型:HP1α、HP1β和HP1γ(分别由CBX5、CBX1和CBX3基因编码),在哺乳动物配子发生、受精、胚胎的着床及胚胎发育过程中都有着自己独特的作用,本文主要对HP1的各个亚型在哺乳动物生殖过程中的作用及其异常对生殖过程的影响作一综述。     

DJ-1~（L166P）与DJ-1~（M26I）基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的在细胞学水平比较DJ、DJ-1M26 I、DJ-1L166 P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础。方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166 P和DJ-1M26 I组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组（P〈0.05）,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞（P〈0.05）。结论 DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的。     

Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.     

血管细胞黏附分子-1对卵巢癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨过表达血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)对卵巢癌细胞凋亡的影响。方法:构建过表达VCAM-1的慢病毒载体GV358-VCAM1+,转染人类卵巢癌IGROV1细胞株,利用嘌呤霉素筛选稳定表达VCAM-1的IGROV1细胞,通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,确定细胞转染效率,Western blot及RT-PCR法确定卵巢癌细胞VCAM-1蛋白和m RNA水平;采用流式细胞仪检测过表达VCAM-1的IGROV1的细胞凋亡变化,western blot法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3)以及STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的变化。结果:成功构建的慢病毒载体GV358-VCAM1+在IGROV1细胞中的转染效率达到85%以上,转染细胞的VCAM-1蛋白及m RNA水平均呈稳定表达;VCAM-1过表达卵巢癌细胞的细胞凋亡显著高于空载体对照组(P=0.0149);Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3表达水平均较对照组显著升高(P0.01),Bcl-2、p-STAT3表达水平明显低于对照组(P0.01),但STAT3表达水平无显著改变。结论:VCAM-1可能通过下调STAT3的磷酸化水平诱导卵巢癌细胞凋亡。     

创伤性骨折血清ALP、OPG表达与Th1/Th2平衡的相关性分析

摘要 目的：探讨创伤性骨折血清碱性磷酸酶（ALP）、骨保护素（OPG）表达与辅助性T细胞1（Th1）/辅助性T细胞2（Th2）平衡的相关性。方法：选取我院2019年2月到2022年12月收治的80例创伤性骨折患者作为研究对象,将其分为观察组,另选取同期来我院体检的80名健康志愿者作为对照组。抽取观察组患者入院后第二天清晨空腹静脉血和对照组清晨空腹静脉血,检测ALP、OPG、Th1、Th2表达水平,并分析血清ALP、OPG表达与Th1/Th2平衡的相关性。术后12个月后对观察组80例患者进行随访,依照患者骨折愈合程度将其分为骨折愈合组（n=54）和延迟愈合组（n=26）,对比两组患者临床一般情况与ALP、OPG、Th1/Th2表达水平,并分析创伤性骨折患者骨折愈合情况影响的多因素。结果：观察组与对照组ALP、OPG表达与辅助性T细胞水平对比差异显著,观察组ALP、OPG、Th2水平明显高于对照组,Th1、Th1/Th2水平明显低于对照组（P＜0.05）;Spearman相关分析结果表明：血清ALP、OPG与Th1/Th2平衡呈负相关（P<0.05）;骨折愈合组和延迟愈合组患者性别、年龄、致伤原因、Th2对比无明显差异（P＞0.05）,两组患者BMI、合并感染ALP、OPG、Th1、Th1/Th2水平对比差异显著（P＜0.05）;对上述单因素分析具有统计学差异指标进行赋值,多因素分析结果表明：ALP、OPG、Th2、Th1/Th2为影响创伤性骨折患者骨折愈合情况的独立影响因素（P＜0.05）。结论：创伤性骨折的发生会导致ALP、OPG水平升高,Th1/Th2平衡改变,患者血清ALP、OPG水平与Th1/Th2平衡关系具有明显相关性。另外,ALP、OPG、Th1、Th1/Th2水平变化可影响创伤性骨折患者术后骨折愈合水平。因此,临床上对于ALP、OPG水平升高,且Th1/Th2失衡患者需警惕骨折愈合不良的发生。     

上皮剪接调节蛋白1的研究进展

上皮剪接调节蛋白1(Epithelial splicing regulatory protein 1,ESRP1)是近年来发现的一种上皮细胞特异性剪接因子,主要通过选择性剪接在转录后水平调节基因的表达,继而影响细胞的功能。研究表明,ESRP1通过调控上皮间质转化、细胞周期进展、氧化还原反应以及脂肪酸代谢等过程,多方面参与肿瘤的发生、发展和对治疗药物的反应。小鼠实验研究表明,ESRP1基因敲除可以导致多种器官发育异常,包括颅面部畸形、皮肤屏障功能受损、肾脏以及耳蜗发育不良等。此外,ESRP1还可以通过调控转录因子的活性以及非编码RNA的生成,提高小鼠成纤维细胞重编程为多能干细胞的效率并维持人胚胎干细胞的多能性。鉴于ESRP1在多个研究领域的重要性,本文对ESRP1常见的下游靶分子、信号通路、以及在生理病理环境下所发挥的功能进行阐述,以期进一步指导基础研究和临床应用。     

桥本甲状腺炎患者外周血miR-142-3p、miR-125a-5p水平与甲状腺功能和Th1/Th2及Th17/Treg细胞平衡的关系

摘要 目的：探讨桥本甲状腺炎（HT）患者外周血微小核糖核酸（miRNA）-142-3p、miR-125a-5p水平与甲状腺功能和辅助性T细胞（Th）1/Th2及Th17/调节性T细胞（Treg）细胞平衡的关系。方法：选取2020年1月～2023年8月我院收治的HT患者90例作为HT组和同时间段90名体检健康者作为对照组,根据甲状腺功能减低程度将HT患者分为甲状腺功能正常组（26例）、亚临床甲状腺功能减退组（31例）和临床甲状腺功能减退组（33例）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测外周血miR-142-3p、miR-125a-5p水平,酶联免疫吸附法检测甲状腺功能指标[甲状腺球蛋白抗体（TgAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、促甲状腺激素（TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT₃）、游离甲状腺素（FT₄）],流式细胞术检测外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例,并计算Th1/Th2及Th17/Treg比值。通过Pearson/Spearman相关性分析HT患者外周血miR-142-3p、miR-125a-5p与甲状腺功能、Th1、Th2、Th17、Treg的相关性。结果：HT组外周血miR-142-3p、miR-125a-5p、TgAb、TPOAb、TSH、Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg比值高于对照组,FT₃、FT₄、Th2、Treg比例低于对照组（P＜0.05）。甲状腺功能正常组、亚临床甲状腺功能减退组、临床甲状腺功能减退组外周血miR-142-3p、miR-125a-5p、TgAb、TPOAb、TSH、Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg比值依次升高,FT₃、FT₄、Th2、Treg比例依次降低（P＜0.05）。Pearson/Spearman相关性分析显示,HT患者外周血miR-142-3p、miR-125a-5p与TgAb、TPOAb、TSH、Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg呈正相关,与FT₃、FT₄、Th2、Treg呈负相关（P＜0.05）。结论：HT患者外周血miR-142-3p、miR-125a-5p水平升高,与甲状腺功能减退和Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡有关。     

Aspects of cellular physiology that influence DNA-mediated gene transfer in NIH3T3 cells

Cellular physiology has a significant influence on the efficiency of various gene transfer procedures, as shown by the fact that transfection efficiency varies dramatically among different cell lines. However, the aspects of cellular physiology which influence the transfection process remain substantially uncharacterized. In this study, NIH3T3 cells were treated with inhibitors of protein synthesis, DNA synthesis, and RNA synthesis to determine the importance of these processes in the calcium-phosphate transfection process. The results suggest that protein synthesis during the first 4 h after DNA addition enhances transfection. In contrast, inhibition of RNA synthesis has no effect on transfection during the first 24 h post-DNA addition. The DNA synthesis inhibitor results remain inconclusive due to a secondary inhibition of an unknown cellular factor. Secondly, agents that destabilize microtubules, microfilaments, and the golgi apparatus were used to determine whether these elements play a role in the transfection process. The results suggest that microtubules are not involved in the transfection process, microfilaments are important but not necessary for the transfection process, and a functional golgi apparatus is essential early in the transfection process. These studies provide a foundation from which further investigations into the cellular processes involved in the uptake and expression of exogenous DNA can proceed.     

V-fos基因对NIH3T3细胞转化的研究

本文报道了用含v-fos基因的pFBJ-2质粒转染NIH 3 T 3细胞,获得了转化细胞株。对细胞株的研究结果表明:(1)Southern杂交检测到细胞基因组中有v-fos基因的整合;(2)点杂交测得有v-fos mRNA的表达;(3)出现一系列转化表型,包括细胞形态的改变,异常的增长速率,在软琼脂上的贴壁不依赖性生长,对低血清浓度培养液的适应性以及细胞膜表而超微结构的变化等,提示v-fos基因能使NIH 3 T 3细胞发生转化,并在体外转化过程中起决定性作用。     

一种快捷可靠评价链霉菌噬菌体φC31整合酶功能的双荧光报告系统

在NIH3T3细胞中构建了一种链霉菌噬菌体φC31整合酶报告系统.该报告载体同时编码红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白,与编码φC31整合酶的载体共转染可以反映φC31整合酶的活性.细胞中从红色荧光到绿色荧光的变化和百分比的变化可经流式细胞仪检出.随着转染中φC31整合酶表达载体的比例升高,表达绿色荧光的细胞比例上升.φbC31整合酶表达载体和报告系统载体比例在10:1时,可达最高约90%的红绿荧光转变率.这表明该φC31整合酶报告系统提供了一种在细胞中快捷可靠的评价φ31整合酶功能的方法.     

Transforming genes in human tumors

DNAs isolated from a variety of human tumor cell lines as well as from naturally occurring human carcinomas and sarcomas were shown to induce morphologic transformation upon transfection into NIH/3T3 cells. All tested transformants contained human DNA sequences, some of which specifically cosegregated with the malignant phenotype in additional cycles of transfection. Southern blot analysis of second cycle transformants derived from T24 human bladder carcinoma cells showed the presence of a single 15 kbp EcoRI fragment of human DNA. These sequences were molecularly cloned utilizing λ Charon 9A as the cloning vector. The resulting recombinant DNA molecule, designated λ T24-15A, was shown to contain an internal 6.6 kbp Bam HI fragment of human DNA that transformed NIH/3T3 fibroblasts with a specific activity of 5 × 10⁴ focus forming units per picomol. These results indicate that we have moleculary cloned an oncogene present in T24 bladder carcinoma cells. Comparison of molecular clones containing the T24 oncogene and its normal homologue did not reveal biochemical differences that helped to explain the malignant properties of this oncogene. Finally, we report preliminary results indicating that the T24 bladder carcimoma oncogene is highly related to the transforming gene of BALB-MSV, an acute transforming retrovirus.     

Cell transformation as aberrant differentiation：Environmentally dependent spontaneous transformation of NIH 3T3 cells

NIH 3T3 cells, a mouse fibroblast cell line used as routine target cells for transfection experiments, undergo spontaneous transformation in our experiments after they form a confluent sheet in medium containing fetal bovine serum (FBS) or lower coneentration of calf serum (CS). The transformation takes the form of foci of multiplying cells among the surrounding cells which have stopped cell division. However, no focus of transformed cells could be seen in medium containing high concentration (10％) of CS. Further experiments indicated that the frequency of transformation is highly dependent on the concentration of serum and the transformation in CS is changeable when the cells are passaged in FBS. 3~H-thymidine autoradiography has been proved to be a sensitive measurement indicator for focus formation. Our results suggest that the high frequency of transformation and its dependence on confluency as well as on medium composition are characteristics of cell differentiation rather than mutation. The role of the NIH 3T3 cell line as a cancer-initiated cell population and its accelerated transformation by ras oncogene might be considered as a form of tumor promotion is discussed.     

鸦胆子苦醇抑制人前列腺癌DU145细胞生长及作用机制

中药鸦胆子是一种常用的抗肿瘤中草药,鸦胆子苦醇是来源于鸦胆子的主要成分。该研究探讨了鸦胆子苦醇(brusatol)对人前列腺癌DU145细胞的生长抑制及其作用机制。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测鸦胆子苦醇对不同细胞株的生长抑制情况,以及不同浓度的鸦胆子苦醇对DU145细胞的增殖抑制率;应用Hoechst 33258染色法观察鸦胆子苦醇处理DU145细胞后所发生的形态学变化;分别采用PI单染及AnnexinV-FITC双染法流式细胞术分析细胞周期分布个凋亡率的变化;以Western blot测定鸦胆子苦醇对MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。结果表明:鸦胆子苦醇对人前列腺癌DU145细胞的抑制作用更为显著,并且可以时间和剂量依赖性地抑制人前列腺癌DU145细胞的生长,其半数有效抑制浓度IC50为(0.27±0.04)μmol·L-1;鸦胆子处理DU145细胞后,Hoechst 33258染色可见到明显的凋亡特征;细胞周期图中可见明显的亚二倍体峰,且随着作用时间的延长凋亡比例增加,FCM检测鸦胆子苦醇作用24 h后凋亡图中,可见凋亡的发生;Western blot检测表明鸦胆子苦醇处理后可使磷酸化的p38和JNK表达增加,使磷酸化的ERK表达降低。鸦胆子苦醇能显著抑制DU145细胞增殖,诱导DU145细胞凋亡。磷酸化的P38和JNK的表达增加,但磷酸化的ERK表达下降,这表明MAPK途径的活化可能是鸦胆子苦醇对DU145细胞生长抑制的作用机制之一。因此,鸦胆子苦醇是潜在的抗前列腺癌药物,有必要进一步在动物水平阐明其抗前列腺癌活性。