烟夜蛾几丁质酶基因的克隆与表达

运用RT-PCR技术扩增编码烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guen啨e)幼虫几丁质酶基因的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得该基因的成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T-2中,并转化入原核细胞中表达,序列测定结果表明,烟夜蛾幼虫几丁质酶基因的成熟蛋白阅读框全长1338bp,编码445个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为50.1kDa和9.26;推导的氨基酸序列与其近缘种棉铃虫几丁质酶氨基酸序列的一致性达99%,与其他6种昆虫几丁质酶的氨基酸序列也高度一致(65%~76%),并具有几丁质酶的典型特征。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上并转化BL21,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导,76kDa附近没有特异蛋白条带出现,表明烟夜蛾几丁质酶基因不能在原核表达载体pGEX-4T-2中表达。     

一种几丁质酶基因的克隆表达及酶解产物分析

【目的】克隆耐冷菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)的几丁质酶基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其酶解产物。【方法】采用PCR扩增法从Pseudoalteromonas sp.DL-6中克隆几丁质酶基因(chi A),连接到表达载体p ET28a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测几丁质酶Chi A的分子量与纯度,4-甲基伞形酮荧光底物4MU-(Glc NAc)2测定酶活,电喷雾质谱(ESI-MS)检测酶解产物。【结果】chi A基因(Gen Bank登录号KF234015)在大肠杆菌中高效表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化几丁质酶Chi A的总活力可达168.68 U。ESI-MS检测结果表明重组蛋白酶解1%胶体几丁质的产物为几丁寡糖。【结论】利用内切几丁质酶Chi A水解几丁质生产几丁寡糖,为其在食品、医药和农业等领域的潜在应用提供有利参考。     

蝴蝶兰几丁质酶基因的克隆及表达特性分析

利用RT-PCR及RACE技术,克隆到蝴蝶兰1个几丁质酶基因PhCHT(GenBank登录号为KT992851),该基因cDNA全长1 210bp,包含37bp的5′-UTR、933bp开放阅读框和240bp 3′-UTR,编码310个氨基酸;该蛋白为糖苷水解酶第19家族成员,兼具有溶菌酶活性;生物信息学分析显示,该蛋白具N-端信号肽和跨膜结构,为胞外分泌蛋白;该蛋白与海枣、谷子、油棕和拟南芥的几丁质酶类似蛋白相近,并且在系统进化树上与甘蔗和陆地棉的Ⅶ类几丁质酶同属一个分支。PhCHT基因的表达分析表明,PhCHT在蝴蝶兰营养器官和生殖器官中均有表达,根中表达量最高;13℃/8℃低温处理3、6、9和15d时该基因的表达被抑制,4℃低温处理1、2和4h表达量升高。研究表明,PhCHT基因能够响应短期的冷胁迫。研究结果为进一步研究蝴蝶兰几丁质酶的系统进化及抗性育种奠定了基础。     

川西云杉几丁质酶基因PlCHI的克隆、表达与生物信息学分析

以川西云杉（Picea likiangensis var.balfouriana（Rehd.et Wils.）Hillier ex Slsvin）为材料,利用RT-PCR技术,克隆获得几丁质酶基因PlCHI的cDNA全长序列,并对该基因的序列特征及基因表达情况进行分析。结果显示,PlCHI的开放阅读框长1017 bp,共编码338个氨基酸;蛋白序列结构域分析结果表明,PlCHI为ClassⅠ类几丁质酶,属19家族,兼具溶菌酶活性;该序列与其他植物几丁质酶的蛋白序列相似性较高。系统发育分析结果显示,川西云杉PlCHI序列与北美云杉（Picea sitchensis（Bong.）Corr.）、黑松（Pinus thunbergii Parl.）等松科植物亲缘关系最近。进一步将PlCHI重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中,表达出约45 kD的蛋白,主要以包涵体形式存在,且在25℃下采用0.2 mmol/L的IPTG诱导4 h时蛋白的表达量最佳。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

小麦几丁质酶基因Wch2的克隆与表达分析

利用小麦几丁质酶基因PCR特异片段为探针,分离克隆了一个小麦Chidl几丁质酶基因Wch2。该基因编码311个氨基酸,不含内含子,具有一个信号肽、一个富含半胱氨酸的几丁质结合区域、两个变异区、两个酶活性区域。Southern分析表明,在小麦基因组中Wch2有多个拷贝。秆锈菌接种诱导Wch2在一对小麦近等基因系中差异表达;在抗病系中国春Srll中,接种3d后Wch2开始表达,6d后表达量更高;而在感病等基因系中国春srll中,在所有取样分析的时间内均未检测到Wch2表达。将Wch2克隆到细菌表达载体pET22b,在细菌中表达的重组Wch2具有几丁质酶活性。这些结果说明,分离的Wch2基因在小麦秆锈菌诱导的抗性反应中具有重要作用。     

东方百合‘演员’DXS基因的克隆与表达分析

以东方百合‘演员’花瓣为试验材料,采用RACE技术,克隆得到百合1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS的cDNA全长,命名为LeDXS(GenBank登录号为MF576067)。序列分析表明,LeDXS基因cDNA序列全长2 471bp,其中开放阅读框包含2 142bp,编码713个氨基酸,相对分子量大小约为76.3kD,等电点为6.65,化学式为C_(3370)H_(5374)N_(942)O_(1016)S_(32)。系统进化分析结果显示,LeDXS与猕猴桃和万寿菊DXS聚为一类,属于Ⅰ型DXS,是功能较保守的一类。实时荧光定量PCR结果分析表明,LeDXS基因在不同品种百合花瓣中均有表达,且浓香型百合DXS基因表达量比淡香型和无香型百合高。该研究结果为百合DXS生物学功能研究奠定了基础,同时也为百合花香育种提供了理论依据。     

哈茨木霉几丁质酶cDNA基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

为研究哈茨木霉 (Trichodermaharzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因 ,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析 ,成功获得了哈茨木霉几丁质酶v(ChiV)基因的全长cDNA序列。该基因的编码框长度为 1194bp ,编码 397个氨基酸 ,理论分子量为 4 4kD。将该基因构建到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上 ,转化到酿酒酵母H15 8菌株中 ,通过Northern杂交检验后 ,确定该基因在酿酒酵母转录水平上表达。在 β_半乳糖诱导下 ,转化子在培养 6 0h时产生的酶活活性最高 ,几丁质酶V最适活性温度为 37℃ ,在pH 6和pH 8时活性较高。     

烟曲霉几丁质酶基因的克隆与表达

Chi4 4是烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)YJ-407产生的一种胞外几丁质酶。通过用真菌几丁质酶保守氨基酸序列与Chi44的N-端序列检索烟曲霉部分基因组序列数据库 ,获得一个编号为contig555的烟曲霉基因组序列 ,可能包含烟曲霉几丁质酶的基因。根据检索结果用RT-PCR方法从烟曲霉YJ-407中克隆到1.4kb的cDNA片段 ,该cDNA的ORF编码一个395个氨基酸的蛋白 ,分子量为43.6kD。对其推导氨基酸序列分析表明该蛋白与其它真菌来源的几丁质酶同源 ,而且活性中心与人巨噬细胞几丁质酶高度同源。该cDNA已在E .coli与PichiapastorisGS115中获得表达 ,分别获得 43kD和44kD的重组蛋白 ,两种重组蛋白均有几丁质酶活性。与野生酶相比 ,大肠杆菌表达的43kD重组酶及Pichia酵母表达的44kD重组酶稳定性下降 ,说明Chi44的糖基化修饰可稳定酶蛋白.     

一株Sanguibacter sp.C4产几丁质酶基因的克隆与表达

Chi58是Sanguibacter sp．strain C4产生的一种胞外几丁质酶。通过chiA的特异性PCR引物探测到菌株C4中存在几丁质酶,并将扩增到的几丁质酶基因片段（chiA-F）克隆、测序后,提交GenBank数据库进行同源性搜索。对从GenBank中获得的高同源性序列进行比对,并根据保守区域设计2对PCR引物进行嵌套PCR,扩增出Chi58基因的开放阅读框（ORF）。测序结果表明该酶的ORF由1692个核苷酸组成,编码563个氨基酸,在N端有23个氨基酸的信号肽,其成熟蛋白的分子量应为58．544kDa。对其推导氨基酸的序列分析表明Chi58与沙雷氏菌的几丁质酶（如徂）有高度同源性（88．9％-99．6％）,其结构主要包括信号肽序列、PKD结构域和18家族糖苷水解酶结构域。将该基因克隆到pET32a（＋）载体构建重组质粒pChi58,转入大肠杆菌BL-21（DE3）进行融合表达。经IPTG诱导后,可见分子量约81．1kDa的融合蛋白的表达。     

朱砂叶螨几丁质合成酶基因1全长cDNA的克隆与表达分析

【目的】克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质合成过程中的关键酶几丁质合成酶基因,并检测该基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【方法】本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及c DNA末端快速扩增(RACE)技术首次克隆获得朱砂叶螨几丁质合成酶基因1的全长c DNA序列(命名为Tc CHS1,Gen Bank登录号为KM242062),并使用实时荧光定量PCR技术首次检测了Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【结果】朱砂叶螨Tc CHS1基因的c DNA全长为4 881 bp,包括198 bp的5'非翻译区(5'-UTR),4 425 bp的开放阅读框(ORF),258 bp的3'非翻译区(3'-UTR),开放阅读框编码1 474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.35 ku,理论等电点为6.26。其包含EDR和QRRRW这2个几丁质合成酶基因的标签序列。氨基酸序列同源性分析结果表明:Tc CHS1与其他昆虫该基因编码蛋白的氨基酸序列相似度在50%左右,与二斑叶螨Tetranychus urticae的氨基酸相似度最高(98%),与西方盲走螨Metaseiulus occidentalis的相似度为55%。分子系统进化的结果也表明Tc CHS1与其他昆虫的CHS1聚在一起,并且和二斑叶螨具有最近的亲缘关系。荧光定量分析表明Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育的不同阶段(卵、幼螨、第1若螨、第2若螨、雌成螨和雄成螨)均有表达,在卵和雌成螨中的表达量较高,在第2若螨的表达量最低。【结论】Tc CHS1基因可能在朱砂叶螨生长发育过程中具有重要作用。     

莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因的克隆与表达分析

【目的】为揭示昆虫病原真菌分泌的几丁质酶对宿主感染致病时的作用,对莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因进行了克隆与表达,并检测了表达产物的活性。【方法】采用CTAB法提取菌体DNA,设计特异性引物,多次PCR扩增克隆莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因全序列,并克隆基因的ORF片段chit1,与载体pPIC9K相连接,构建表达载体pPIC9K-Chit1,转入毕赤酵母感受态细胞中,然后通过1.5mg/L浓度的G418筛选及PCR验证,将阳性转化子进行诱导培养,对发酵液分别进行酶活性测定试验、几丁质酶透明圈验证试验和SDS-PAGE电泳检测。【结果】莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因全长序列为2756bp(NCBI登录号:EU795711),PCR扩增得到开放阅读框ORF片段chit1为1827bp,其中包含3个内含子,5′端非编码区长76bp,3′端非编码区240bp,编码424个氨基酸的几丁质酶前体,理论信号肽剪切位点在Gly(20)与Leu(21)之间;毕赤酵母重组细胞发酵液中几丁质酶活性随着发酵时间的延长而增加,72h达到最大值482.5U/100μL,透明圈活性验证试验显示,在含1%的几丁质平板上可出现明显的透明圈,表达产物SDS-PAGE电泳检测其分子量为41.0kDa。【结论】本研究克隆到莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因,其ORF成功重组到毕赤酵母中并表达出有活性的几丁质酶。基因表达产物的利用对进一步研究病原真菌染病昆虫的机制等具有重要意义。     

小地老虎几丁质酶基因的克隆与序列分析

利用昆虫几丁质酶对几丁质的调控作用破坏几丁质新陈代谢的平衡来防治害虫, 在生物防治策略中具有很大的发展潜力。从处于预蛹期的小地老虎Agrotls ipsilon (Hufnagel)体中肠内提取总的RNA, 经反转录, 利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得了几丁质酶基因的cDNA序列。该基因序列已经登录GenBank并获得登录号为EU035316。该序列长度为2 823个碱基, 含有一个1 674个碱基的开放读码框。开放读码框编码558个氨基酸残基, 预测的分子量为62.5 kDa, 等电点5.12。推导得到的氨基酸序列含有2个N-位糖基化位点,20个O-位糖基化位点, 含有2个几丁质酶所具有的保守序列：N-端的催化区和C-端的几丁质结合区。氨基酸序列与其他昆虫, 特别是鳞翅目昆虫的几丁质酶高度同源。     

细菌几丁质酶基因的表达调控

几丁质酶可以降解几丁质,广泛存在于各类微生物中。几丁质的降解产物几丁寡糖在医药、食品及农业生防领域有很重要的应用价值及广泛的应用前景。细菌在利用几丁质时,需要先分泌几丁质酶,将几丁质降解成几丁寡糖或单体,再通过特异的转运系统送进细胞而被利用。胞内的几丁质降解产物作为特定的信号分子,可以激活或阻遏相应chi基因的转录,从而影响细菌几丁质酶的合成。在各种调节蛋白及应答元件的参与下,细菌几丁质酶的合成受到精密的控制。文章以链霉菌和大肠杆菌为代表综述了细菌在转运系统和基因表达两个层面上控制几丁质酶合成的最新研究进展。     

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus热稳定几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

根据Thermomyces lanuginosus热稳定几丁质酶Chit的N-端氨基酸序列和同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了该几丁质酶的编码基因chit,全长cDNA为1500bp,包含一个由442个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在GenBank中注册,登录号为DQ092332。将成熟肽几丁质酶Chit阅读框与酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K/chit,转化毕赤酵母GS115,在甲醇的诱导下,成功地分泌出具生物活性的几丁质酶,诱导6d后酶活性达2.261U/mL,酶蛋白表达量为0.36mg/mL。该酶的最适反应温度和pH值分别为60℃和5.5,该酶在50℃以下稳定;65℃的半衰期为40min。     

丽蝇蛹集金小蜂几丁质酶基因鉴定与表达分析

几丁质酶是降解几丁质的糖苷水解酶,参与昆虫蜕皮、器官发育、免疫等重要生理过程。目前,寄生蜂等膜翅目昆虫中几丁质酶的鉴定以及功能研究仍较少。本研究基于生物信息学分析,在丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis基因组中鉴定到14个几丁质酶基因,氨基酸个数介于312~2 682之间。系统进化分析表明丽蝇蛹集金小蜂几丁质酶分为9个亚家族,其中Group Ⅳ、Ⅶ亚家族可能通过基因串联复制而发生基因家族扩增。qRT-PCR分析结果表明几丁质酶基因的表达具有多样性,其中NvCht1、NvCht5、NvCht6、NvCht7 4个基因在1.5 d幼虫表达量最高,NvCht3在5 d幼虫表达量最高,NvCht8在幼虫期高表达。此外,幼虫组织中的表达分析结果表明NvCht4、NvCht5、NvCht10、NvCht12在表皮中高表达,NvCht7、NvCht8、NvCht13在肠道中高表达,NvCht9在脂肪体和表皮中高表达,NvCht11在唾液腺中高表达。本研究为寄生蜂几丁质酶的进化分析以及功能研究提供理论基础。     

一种新的抗真菌几丁质酶基因的分离及其植物表达载体的构建

以西瓜尖镰孢菌诱导、提纯的豇豆抗真菌 I类几丁质酶 N端前 1 0个氨基酸序列测定的基础上 ,设计合成了引物 ,运用 PCR等分子生物学技术 ,从豇豆基因组中分离克隆了该特异几丁质酶成熟蛋白基因 ,测定分析了其全序列。该新基因全长 894bp,无内含子 ;具 Aat I、Aat II、Bgl I、Dpn I、Dpn II、Eco R II、Hae I、Hae II、Hae III、Hinf I、Hpa II、Mae II、Mae III、Nba I、Oxa I和 Sst IV酶切位点 43个 ;豇豆、Vigna unguiculata、菜豆、豌豆、烟草、小麦、水稻的同源性依次递减。扩增克隆了菜豆几丁质酶信号肽基因 ,并将其与豇豆几丁质酶成熟蛋白基因连接 ,再与 p BI1 2 1重组 ,成功构建了特异几丁质酶基因的植物表达载体 ,为进一步培育抗真菌病转基因西瓜新品种打下了坚实基础。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒几丁质酶基因的克隆与表达

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)几丁质酶基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点,利用PCR扩增出不含N末端信号肽以及C末端内质网定位肽的几丁质酶基因片段.将该基因片断克隆至原核表达载体pProEXHTb,经IPTG诱导,在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达,表达产物的大小为60kD,含量占菌体总蛋白量的40%.利用来源于AcMNPV 几丁质酶的抗体对表达蛋白进行检测,获得特异性的显色信号,证实所获原核表达产物与杆状病毒的几丁质酶具有同源性.     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒几丁质酶基因的克隆与表达

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (HaSNPV)几丁质酶基因的序列 ,设计引物 ,引入适当的酶切位点 ,利用PCR扩增出不含N末端信号肽以及C末端内质网定位肽的几丁质酶基因片段。将该基因片断克隆至原核表达载体 pProEXHTb ,经IPTG诱导 ,在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达 ,表达产物的大小为 6 0kD ,含量占菌体总蛋白量的 4 0 %。利用来源于AcMNPV几丁质酶的抗体对表达蛋白进行检测 ,获得特异性的显色信号 ,证实所获原核表达产物与杆状病毒的几丁质酶具有同源性     

粘质沙雷氏菌几丁质酶基因ChiA克隆及生物信息学分析

通过生物信息学技术对Chi A基因序列进行分析预测,了解Chi A的基因结构及蛋白质性质。从自有菌株(粘质沙雷氏菌Serratia mareescens S68)中克隆到几丁质酶基因Chi A,利用相关软件对Chi A基因序列进行分析预测。Chi A基因全长1 714 bp,开放阅读框编码563个氨基酸,推测其编码的蛋白质分子量为60 983.8Da,等电点为6.35,是一种稳定的亲水性蛋白质。预测Chi A可能存在信号肽,切割位点在第23~24位氨基酸之间,1~23位氨基酸为其跨膜结构,其余肽链位于细胞外。Chi A主要存在3种二级结构元件,在二级、三级结构中都有体现。该Chi A是一种水溶性蛋白质,结构稳定且可以分泌到胞外。