幼畜腹泻双价基因工程疫苗(K88、K99)抗原蛋白的生产工艺

本文报道了在幼畜腹泻双价基因工程菌(K88、K99)的高密度发酵和抗原蛋白基因过量表达的研究基础上生产抗原蛋白疫苗的工艺。高密度发酵的工程菌(K88、K99)发酵液经65℃保温处理、离心除去菌体,清液部分含发酵液中抗原量的80％,加聚乙二醇(至最终浓度为7％)沉淀可回收全部抗原蛋白,加消毒的生理盐水溶解及稀释后分装冻干制成抗原蛋白疫苗。疫苗的组成份主要有分子量为52、36、22、18kd的蛋白。此法制备的双价疫苗不经甲醛处理,保持了抗原蛋白的天然空间结构,因此用其免疫怀孕的母猪、分娩后母猪乳汁中含有较高效价的抗体、能中和肠毒素大肠杆苗,有效地保护了仔猪黄痢的危害。     

幼畜腹泻双价基因工程疫苗(K88、K99)的高密度发酵生产工艺及抗原过量表达

本文报道了幼畜腹泻双价基因工程疫苗(K88、K99)的高密度发酵生产工艺和抗原基因的过量表达研究结果。采用New Biunswick公司发酵罐,主要发酵参数为搅拌速度1000rpm,通气量为18L／min,溶氧为25％,pH6．5,罐压为48．3kPa,温度37℃,发酵时间为20h。菌体浓度为A 6 0 0 nm40以上,K88、K99抗原效价分别达212水平。发酵过程中发现表达的抗原除装配细菌伞毛之外,过量表达的抗原以相当于伞毛中抗原浓度游离存在于溶液中。含双价疫苗基因的表选型质粒的稳定性在发酵20h后保持在70％。本文结果表明利用小型发酵罐(10L发酵液)每次可制备10000支疫苗,完全可以满足对幼畜腹泻基因工程疫苗盼大量需要。     

毒素源性大肠杆菌K88ac抗原基因的次级克隆和重组质粒的限制图

从我国引起仔猪腹泻的野生株E. coli 79-1454克隆了K88ac抗原基因,获得了重组体E. coli RR1(pNZ8801),分子量为10 Md。为了得到分子量更小的重组体,用E．coRI消化重组质粒,除去中间约3.2 Md的片段,得到次级克隆株E. coli RR1(pNZ8802),质粒分子量为6.8 Md。测定其K 88ac抗原为阳性,而且其产生的K88at抗原量略高于初级克隆株。电镜照片表明重组体表面长有菌毛。萤光抗体染色和猪刷状缘细胞粘附试验亦表明有良好的粘附生物活性。此重组体可以与本人克隆的K99抗原基因构建成复合重组体。本文还作了重组体的限制性酶切图。     

克隆毒素源性大肠杆菌K88ac抗原基因

E.coli79-l454(08：K88ac K31：H^-)是北京生物制品检定所从上海郊区腹泻的仔猪分离到的野生型毒素源性大肠杆菌,该菌产生K88ac抗原,产生热敏感毒素(LT)和热稳定毒素(sT)。发酵棉子糖,抗四环素,含有50Md的大质粒。用碱变性法提取,以线性cscl-EB密度梯度离心法纯化大质粒,用HindⅢ酶消化,回收6.5Md的片段,与载体pBR322连接,转化到E.coliRRl,选出Ap¹Tc²的转化子,用玻片凝集,琼艚扩散。K88ac抗血清致敏的绵羊红细胞反向间接血凝,被动溶血,ELISA等方法检测K88ac抗原均为阳性的重组体,其中一株命名为E.coliRR1(pMM031),酶切图谱表明除含pBR322 DNA的片段外,还台有约为6．5Md的片段,此片段是HindⅢ酶消化大质粒DNA产生的第二条片段,含有为K88ac抗原基因编码的遗传决定子。用LT基因探针菌落原位杂交,Y—l肾细胞试验等方法检测结果表明重组体不产生LT;用乳鼠试验及STb基因探针杂交均是阴性,说明重组体不产生ST。由此可见重组体产生K88ac抗原,但无毒性,有可能用作疫苗栋,也可以与其他因子配伍构建成更好的活疫苗株。     

用遗传工程技术构建含E．Coil K88ac和 LT(A-B+)两种抗原基因的菌株

用我室克隆的含大肠杆菌K88ac抗原基因的pMM031质粒和含肠毒素LT(A^-B⁺)抗原基因的质粒pPMc4,使用限制性内切酶BamHI酶解,取得了K88ac抗原基因的片段,再经和BamH I消化的质粒pPmc4连接重组,构建了同时具有这两种抗原基因的质粒pMM085羟琼脂糖凝胶电泳分析,pMM085质粒的分子量约为14．6Md,在宿主菌E．CoilC600,经过ELISA和反向间接血凝等几种试验测定K88ac抗原,结果都说明其抗原产量与亲本菌株基本相同。重组菌的抗甘露糖豚鼠红细胞凝集反应也是阳性。对肠毒素抗原用被动溶血试验测定,结果说明其LT-B的产量和亲本菌的产量也基本相同。重组的工程菌株经兔肠结扎试验表明没有毒性反应,因此重组菌株可以作为预防仔猪腹泻的活菌疫苗候选株。     

工程大肠杆菌K99抗原蛋白的分离纯化及其特性的研究

本工作采用了快速、简便的方法从大量培养的基因工程菌E.coil 1548(pHK99)表面分离和纯化了K99抗原蛋白,纯化产物在SDS-PAGE上呈现-条蛋白带,该蛋白的分子量约为16500,PAS反应结果表明该蛋白为糖最白,等电聚焦证实该蛋白pI为9．5,用免疫学方法证实了该蛋白大量存在于细菌表面,并具有较好的热稳定性,文中还讨论了该蛋白在不同培养基中的表达。     

猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac粘附抗原的核苷酸序列分析

 本文对国内流行的猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac抗原的结构基因的核苷酸序列进行了测定。该基因由849对核苷酸组成,编码了283个氨基酸的蛋白亚单位及21个氨基酸的信号肽。与国外报道的K88ac序列的不同是我们发现一个碱基的点突变,导致在抗原决定簇内一个氨基酸的改变。从核苷酸序列推导出的氨基酸序列与另两种亚型进行了比较。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

K_(99)—F_(41)双纤毛菌的构建

产肠毒素大肠杆菌能引起仔猪、犊牛、羔羊等新生幼畜发生急性腹泻、K_(99)和F_(41)是这类产肠毒素大肠杆菌所产生的两种在免疫性质上不同的纤毛抗原。 提取K_(99)质粒,用HindⅢ酶消化,再用低熔点琼脂糖电泳回收分子量约为11Md的K_(99)的HindⅢ片段,并将该片段与经过碱性磷酸酶处理的PBR322载体重组,转化大肠杆菌C_(600)。用ELISA筛选K_(99)抗原阳性克隆。 E.coli83919F_(41)~+是非致病的产生F_(41)纤毛抗原的野生菌株。且F_(41)抗原基因是由染色体编码的。采用转化的方法将K99人工重组质粒转化到E.coli83919F_(41)~+中构建成K_(99)—F_(41)双纤毛基因工程菌。双纤毛菌中K_(99)抗原表达达到给体菌的水平,而F_(41)抗原的表达未受到明显的干扰。     

K88抗原基因的克隆与表达I．K88抗原工程菌的研制

由产肠毒素大肠杆菌引起的仔猪黄痢病是在世界各地广泛流行的一种仔猪急性腹泻病。已经表明K88伞毛抗原在这类致病菌定居在仔猪小肠上起着重要的作用。质粒Ptk82是从国内流行的仔猪黄痢病致病菌——肠杆菌青3菌株中分离出来的。它是一个分子量约为50×10‘道尔顿的非接台型质粒,并含有K88ac抗原基因的决定子。在电子显微镜下可以观察到带有Ptk82的大肠杆菌C₆₀₀的细胞表面存在有K88伞毛。此质粒DNA经限制性内切酶HindI酶解后,使DNA片段连接到同样经内切酶酶解过的的Pbr322 DNA上,得到了一株能产生K88抗原的转化子,经鉴定后,此重组质粒定名为Ptk63。Ptk63dna经Ec0R I都分酶解,然后重新连接起来,得到分子量较小但仍台K88基因的重组质粒Ptk90。免疫学分析的结果表明,带有重组质粒Ptk90的大肠杆菌C₆₀₀所产生的伞毛抗原的性质,与带有Ptk82质粒的大肠杆菌C₆₀₀菌株或大肠杆菌青3菌株所产生的伞毛是相同的,大肠杆菌C₆₀₀／pTK82和大肠杆菌C600／pTK90菌株都是不带肠毒素基因的菌株,初步试验表明用它们制成的菌苗可以有效地预防仔猪黄痢病的发生。     

旋毛虫基因重组抗原的纯化

根据旋毛虫基因重组抗原蛋白的特点,筛选出裂解处理工程菌菌体的方法,并探索了用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００（ＨＲ）柱层析纯化重组蛋白的程序。用本法处理和纯化后,重组蛋白的纯度可达９０％以上。所纯化的三种重组抗原蛋白均能与猪旋毛虫病血清发生特异性反应而不与正常猪血清和猪囊虫病血清反应,其中以重组蛋白ＲＰ３４的特异性最强,ＲＰ３７较弱,ＲＰ４６介于两者之间。研究结果表明,本纯化方法易于操作、设备简单和特异性蛋白回收率高,是处理和纯化旋毛虫基因重组抗原的最佳程序。     

共表达ETEC K99、GFP重组大肠杆菌的构建及表达北大核心

[目的]构建K99、GFP基因重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中表达。[方法]利用PCR扩增技术扩增K99基因和GFP基因,经连接和转化将目的片段克隆到pLA载体上,利用双酶切技术及PCR技术对重组质粒进行鉴定并测序分析,利用Western Blot技术分析蛋白质表达情况。[结果]测序分析结果表明,基因具有正确的阅读框;双酶切和PCR鉴定得到498 bp和720 bp的特异性条带;荧光检测表明重组菌表达了蛋白;Western Blot结果表明重组菌表达为融合蛋白。[结论]成功构建了大肠重组菌,并表达外源融合蛋白。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

一类不具有K88和K99抗原的大肠杆菌对仔猪小肠上皮的粘着性和电镜形态观察

由北京市农业科学院畜牧兽医研究所提供的苇沟5、巨山1及大兴1三个仔猪黄痢病原性大肠杆菌菌株,都不具有K88和K99抗原,但它们对仔猪都有很强的致黄痢作用。它们的菌体O抗原部属O64,同时具有一个共同的K(L)抗原。这三个菌株均能强烈地粘着于仔猪迥肠和空肠的粘膜绒毛上皮上。电镜形态观察,可见菌体表面有多条菌毛样结构,在铬喷镀投影标本中,这种菌毛可长达4μm。这类不具有Kss和K99抗原的肠病原性大肠杆菌菌株同时具有另一种与菌毛有关的表面粘着素K抗原。     

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)是我国分布最广的蟑螂种类.黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus, PfDNV)是我室1991年在国内首次报道并在国内外第一个分类鉴定的蟑螂细小病毒[1].我们构建了PfDNV全基因组克隆和酶切亚克隆重组质粒,测定并分析了病毒基因组全序列与结构.序列分析表明该病毒基因组具有细小病毒基因组的结构特征,其末端具有反转重复序列(Invert Terminal Repeatant, ITR)和回文结构,这类病毒基因组两端的特殊结构可能是与病毒复制,整合,拯救,包装有关的必需顺式元件[2～5].为了进一步研究黑胸大蠊浓核病毒基因复制及表达机理,尤其是其末端结构在病毒基因复制中的作用,我们将荧光素酶基因插入了PfDNV基因组保留了两个完整的末端结构而其它部分缺失的重组质粒中.将这种重组质粒转染虫体后,在虫体中检测到了荧光素酶的表达,说明在缺失基因组中间部分时,插入的外源基因依然可以复制、表达.本结果证实了PfDNV基因组的末端结构是PfDNV复制的必需结构.这一实验为将外源基因引入病毒基因组,构建基因工程杀虫剂提供了有效的技术途径.现将结果报告如下.     

幽门螺杆菌STM文库重组质粒的构建

目的:应用信号标签突变技术(Signature tagged mutagenesis,STM)构建幽门螺杆菌突变体文库重组质粒。方法:采用平末端内切酶随机酶切幽门螺杆菌基因组DNA,并回收300～500bp片段(记作Fr),基因重组技术构建重组质粒pID700-Fr,电转化E.coliDH5α筛选阳性克隆,提取重组质粒酶切鉴定。结果:成功构建了1200个幽门螺杆菌STM文库重组质粒。结论:STM技术可用于幽门螺杆菌致病以及耐药相关基因的筛选,为幽门螺杆菌致病及耐药机理的研究奠定了基础。也将为幽门螺杆菌的治疗提供新的药物靶点。     

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

A luciferase gene has been inserted into the recombinant plasmid PfDNV-pUC119 which contained partly deletion of genome of Periplanete fuliginosa densovirus(PfDNV.)The recombinant plasmid with luciferase gene was co-transfrected with PfDNV-pUC 119 into Periplanele fuliginosa larvae and had a high luciferase gene expression in enteron of the transfected larvae.     

利用发光酶基因监测根瘤菌重组质粒的转移性

经三亲本杂交,比较测定了重组大豆根瘤菌HN01DNL和TA11DNL中所含重组质粒pHN307在人工滤膜和灭菌土壤杂交条件下、向华癸中生根瘤菌7653R和荧光假单胞菌Pf.X1-5的转移频率;并初步跟踪了pHN307在根盒-土壤缩影、小区试验和环境释放中向土著细菌的转移性,为考察所构建重组根瘤菌在田间应用时的安全性提供了一定的实验依据。