人β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中HS3与反式调控因子相互作用的研究

人β-簇珠蛋白基因LCR调控元件位于ε-珠蛋白基因5’上游20Kb内,由四个DNase-Ⅰ超敏感点(HS1-HS4)组成。已有转基因实验表明,HS3可能与发育早期的胚胎型ε-珠蛋白基因表达调控相关。基因调控是通过调控元件与调控因子的相互作用而完成的。为了揭示HS3的调控作用,我们选用了发育不同时期的小鼠胚胎造血组织作为材料,用凝胶电泳阻抑法,分析了调控因子与HS3的结合。我们的实验结果表明,怀孕13天和18天的小鼠胚胎造血组织的核蛋白因子与HS3的结合模式完全不同;同时我们用Southwestern Blot的方法进一步证明了这种差异性的存在。现已知HS3中有GA-TA和CACCC两类转录因子结合的motif,采用竞争实验分析,发现CACCC motif对结合区带没有竞争作用,而GATA有竞争作用;另外还存在没有被竞争的条带,我们推测它们可能是一类新的、发育时期专一性的核蛋白因子。Western Blot的实验结果表明,在基因调控过程中起到重要作用的红系转录因子GATA家族中的GATA-1和GATA-2的表达也具有时期专一性:即怀孕13天的小鼠造血组织中表达GATA-2,不表达GATA-1;而怀孕18天的小鼠造血组织中则表达GATA-1,不表达GA-TA-2。因此,我们推测,HS3很可能参与时期专一性的基因表达调控,其中时期专一性的蛋白因子可能起到了重要作用。     

长非编码RNA与造血谱系分化

全基因组测序分析显示,人类基因组中蛋白质编码基因所占比例不足2%,但高达80%的基因位点可以转录出RNA。在这些非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)中,长度超过200个核苷酸的RNA分子被称为长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)。在血液系统中,基于造血不同分化阶段的转录组测序和分析发现,几乎在造血分化各个阶段都有lnc RNA参与。lnc RNA在维持造血干细胞未分化状态、诱导红细胞脱核成熟、粒细胞定向分化以及淋巴细胞迁移等谱系分化过程中均发挥了不可或缺的作用。lnc RNA作为调控因子在转录、转录后以及翻译等多个水平参与造血谱系分化调控。该文综述了近年来lnc RNA在造血分化领域的研究现状,为后续进一步揭示lnc RNA介导的造血调控网络奠定基础。     

转录因子GATA-2在脊椎动物发育过程中的作用

GATA-2是对外胚层和中胚层发育至关重要的转录因子,它属于具有保守锌指结构的GATA转录因子家族.GATA家族包括6个成员:分别命名为GATA-1～GATA-6.最新研究表明,GATA-2不仅存在于胚胎器官,还对成体造血细胞系、神经系统、垂体和泌尿生殖系统中细胞的功能和维持都必不可少.本文旨在通过对GATA-2的功能研究进展进行综述,探讨GATA-2在生殖系统中的作用机制,以期更广泛地了解GATA-2基因在生物发育过程中的作用及对相关基因的调控机制,从而为攻克人类相关疾病提供理论依据.     

基于CRISPR/Cas9技术的GATA-1基因敲除K562细胞系的构建

GATA-1(GATA binding protein-1)在造血分化过程是最重要的转录调控因子,在红细胞和巨核细胞中特异性高表达,并通过调节相关基因的转录在红系和巨核系造血细胞的分化发育过程中发挥重要作用。该研究采用CRISPR/Cas9技术将K562细胞中的GATA-1基因敲除,建立了GATA-1基因敲除K562细胞株。首先,设计了4个CRISPR的靶向位点,利用p GL3-U6-sg RNA-PGKpuromycin质粒构建了4个导向RNA(single guide RNA,sg RNA)载体。利用电穿孔的方法将sg RNA载体与Cas9载体p ST1374-NLS-fl ag-linker-Cas9共转K562细胞。转染48 h,经定点PCR和T7EN1内切酶酶切鉴定后,采用细胞有限稀释法嘌呤霉素筛选,定点测序和Western blot检测结果显示,成功构建了GATA-1基因敲除K562细胞株,命名为K562-KO GATA-1。使用联苯胺染色和流式细胞术的方法检测血型糖蛋白A(glycophorin A,CD235a)发现,与正常K562细胞相比,K562-KO GATA-1细胞株经Hemin诱导红系分化明显受到抑制。综上,该研究建立了敲除GATA-1的K562细胞系,可用于后续的造血分化相关研究。     

长非编码RNA-UCA1影响红细胞增殖

造血是一个高度协调、精密调控的过程。在正常造血分化过程中, lncRNA不仅调控造血干/祖细胞自我更新、分化、凋亡等过程,还决定造血谱系分化命运。关于lncRNA在人的不同造血谱系分化中的功能以及作用机制的研究已比较深入,但其在红系分化过程中的功能和机制的研究很少,仍处于建立差异基因表达谱的阶段。现有的研究表明, lncRNA-UCA 1(urothelial cancer associated 1)作为原癌基因与多种癌症的发生、发展、转移、产生化疗耐药性等密切相关。该研究发现,在体外诱导脐带血来源的CD34+干/祖细胞向红细胞分化的过程中,采用慢病毒感染的方法敲降UCA 1的表达抑制了红细胞的增殖及活力,对RNA-seq数据进一步分析发现,降低UCA 1的表达会影响与细胞周期相关基因的表达。     

GATA结合蛋白4在心脏发育及心肌重塑中的作用

转录因子GATA结合蛋白4(GATA-binding protein 4, GATA-4)在心脏发育和心肌重塑过程中发挥重要的调控作用.GATA-4基因缺失可致胚胎死亡,而不同位点的错义突变将引起不同类型的先天性心脏发育畸形.GATA-4蛋白表达水平降低可导致心脏功能进行性下降.压力超负荷、缺氧、交感神经激活等各种心肌肥厚刺激因素均可显著影响GATA-4的DNA结合活性,进而通过调控心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、心肌锚定重复序列蛋白(CARP)等多种心肌重塑相关转录因子的表达参与心肌重塑过程.深入探讨GATA-4的转录调控机制,有望为心血管疾病的防治提供新的线索.本文扼要综述GATA-4在心脏发育及心肌重塑中的研究现状.     

CBP蛋白是转录因子GATA-2的辅激活因子

转录因子GATA家族含有6个成员,分别为GATA 1-6,本实验主要针对GATA-2与CREB结合蛋白（CBP）的关系进行了研究,GATA-2主要在造血祖细胞中表达,对维持这类细胞的非分化状态有重要作用,CBP是多种可调控的与DNA结合的转录因子的辅激活因子,其中包括转录因子GATA-1,目前尚未有报道表明CBP蛋白也是GATA-2的辅激活因子,本研究利用免疫沉淀技术和洗脱技术证明了小鼠的GATA-2能够与CBP结合,而且发生结合的位点分别位于CBP蛋白的CHI,CH3和CT4523个区域,以及GATA-2蛋白的N-finger,N-C-finger和C-finger3个区域,荧光素酶活性测定结果表明,CBP能够以剂量依赖的方式提高GATA-2转录激活的活性,有研究表明,虽然GATA-1主要在已分化的造血细胞中表达,但与GATA-2的表达在时间上仍有重叠,那么是何种机制决定着CBP蛋白与GATA-2选择性结合时维持造血细胞的非分化状态,而与GATA-1结合时诱导造血细胞的分化是一个值得探讨的问题,本文对此进行了讨论,     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1（1）,pDBLeu-GATA1（2）,pDBLeu-GATA1（3）,筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

miR-150在造血发育中的功能研究

miR-150是一个在哺乳动物中表达的含22个核苷酸的miRNA,能通过抑制靶基因的翻译来调控细胞增殖、分化和凋亡等重要的生理、病理过程。miR-150的表达水平在造血发育不同谱系和不同阶段都存在明显差异,而造血发育异常也同样伴随着miR-150的表达异常,提示miR-150能够调控机体造血发育过程,参与了造血发育异常的发生。在机体造血系统中,miR-150主要通过调控其靶基因的表达来影响造血发育过程以及各谱系细胞的成熟、活化与功能效应。目前已报道的miR-150靶分子主要有c-Myb、Notch3、GAB1、FOXP1、Cxcr4、Prf1等。现就近年来miR-150在造血发育过程中的研究作一综述。     

GATA6在肝脏发育中的作用及调控机制

GATA6 (GATA binding protein 6)是GATA锌指转录因子家族成员之一,以其保守的结合基序(G/A)GATA(A/T) 而得名。GATA家族在脊椎动物细胞命运决定与分化、增殖和迁移以及内胚层和中胚层来源的器官发育中具有重要作用。GATA6作为谱系特化因子、染色质重塑因子、多能性因子和“先锋因子”,在内胚层肝脏谱系决定、肝脏特化、肝芽生长以及肝母细胞增殖分化等阶段发挥关键的调控作用。本文综述了GATA6在肝脏发育中的作用及其研究进展,以期为进一步研究 GATA6 等发育关键转录因子的功能及调控机制提供参考。     

棉花锌指蛋白GhZFP1相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

GhZFP1蛋白是从盐胁迫棉花幼苗cDNA文库中分离的一种CCCH型锌指蛋白.初步的生物学功能研究表明,过量表达该基因的转基因烟草耐盐性和抗病性显著提高.为深入研究GhZFP1蛋白的作用机制,构建pGBKT7-m1诱饵表达载体,利用酵母双杂交系统从盐胁迫诱导棉花cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白.通过阳性克隆的表型确定、PCR和限制性内切酶检测以及测序和生物信息学分析,获得9个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白.双分子荧光互补实验证明,GhZFP1与GZIRD19A确实存在互作关系.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究GhZFP1锌指蛋白的未知生物学功能提供重要信息.