不同活力玉米种子胚萌发期间热激蛋白的合成

玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）种子在萌发期间热激处理（４２℃）时蛋白质合成率低于对照（２５℃）;高活力种子胚热激蛋白的合成率最高。在４２℃热激处理时玉米种胚子合成的热激蛋白的分子量分别为７３、６５、６２、５４、１８ｋＤ等５种。高活力种胚合成的热激蛋白在最上高于低活力种子,高活力种胚合成的特异性热激蛋白５６ｋＤ可以作为衡量种子活力的指标。双向电泳表明高低活力种子间热激蛋白的合成有更多质上的差异。     

玉米胚发育过程中热激蛋白的合成

35S-Met标记玉米胚蛋白合成结果表明,热激处理(42℃)与对照(25℃)的蛋白合成趋势相近,热激抑制16 DAP的蛋白合成,增加22和34 DAP蛋白合成.SDS-PAGE自显影图谱表明,热激诱导16DAP的胚合成86.4、80.0、73.2 kD等3种分子量较高的热激蛋白,22DAP后热激诱导合成86.4、80.0、73.2、24.4、18.2、16.8和13.6 kD等7种分子量的热激蛋白.2D-PAGE自显影图谱进一步显示,热激诱导22和28 DAP的胚合成近20种热激蛋白,其中超过10种为小分子热激蛋白.特异热激蛋白BiP(HsP70)、PDI(HsP60)Western blot表明,这2种热激蛋白在玉米胚发育过程均有高水平的表达,热激对其合成影响不明显.     

大鼠热休克蛋白70的融合表达及纯化鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化大鼠热休克蛋白（HSP）70与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白,以进一步研究细胞外HSfr70的生物学功能。方法：用RT-PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体转化大肠杆菌B121,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,建立最佳诱导表达条件;采用Amylose树脂预装柱对目的蛋白进行亲和纯化,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果：克隆出目的基因,构建了融合表达载体pMAL-c2X／hsp70;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带,并纯化出纯度较高的融合蛋白;免疫印迹鉴定表明其具有抗原活性。结论：在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白MBP-HSP70,为进一步研究细胞外HSP70的生物学效应提供了有用的材料。     

cry1A基因在转基因玉米中的遗传与表达

通过Southern杂交、ELISA分析等方法, 研究了cry1A基因在转基因玉米中的遗传与表达.结果表明,cry1A基因在转基因玉米中呈单位点显性基因遗传.cry1A杀虫蛋白在转基因玉米不同株系中的表达量存在显著差异;在转基因玉米同一植株不同组织中的表达量也明显不同,在叶片、苞叶等绿色组织中的表达量显著高于在髓、花丝等非绿色组织中的表达量;在玉米叶片中的表达量随着发育期的推进有上升的趋势;在研究的3个转基因玉米株系中,cry1A杀虫蛋白的表达量在R2、R3、R4代之间无显著差异.     

cry1A基因在转基因玉米中的遗传与表达(英文)

通过Southern杂交、ELISA分析等方法 ,研究了cry1A基因在转基因玉米中的遗传与表达。结果表明 ,cry1A基因在转基因玉米中呈单位点显性基因遗传。cry1A杀虫蛋白在转基因玉米不同株系中的表达量存在显著差异 ;在转基因玉米同一植株不同组织中的表达量也明显不同 ,在叶片、苞叶等绿色组织中的表达量显著高于在髓、花丝等非绿色组织中的表达量 ;在玉米叶片中的表达量随着发育期的推进有上升的趋势 ;在研究的 3个转基因玉米株系中 ,cry1A杀虫蛋白的表达量在R2 、R3 、R4代之间无显著差异。     

人热休克蛋白转录因子1 DNA结合结构域的表达、纯化和晶体生长

目的:获得大量热休克转录因子1(HSF1)DNA结合结构域(DBD)蛋白,用于晶体生长的三维结构解析。方法:将DBD基因片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中并获得高效表达,经过Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析、ResourceQ纯化后,蛋白纯度达到95%以上。结果:圆二色谱仪分析蛋白质的二级结构结果显示α螺旋占33%,β折叠占15%;采用悬滴气相扩散法得到了针状DBD晶体。结论:纯化的蛋白质与同源性达68%的Kluyveromyceslactis的DBD有相似的空间构象。获得的蛋白质晶体为进一步的三维结构解析奠定了基础。     

小鼠热休克蛋白gp96羧基端片段的克隆、表达及纯化

热休克蛋白(Heat shock protein)gp96(Grp94)是近年来新发现的一类糖蛋白,除了分子伴侣的功能外,现有越来越多的献报道了它在先天性免疫和获得性免疫中的重要作用。gp96可以促进抗原呈递细胞的成熟以及细胞因子的分泌。热休克蛋白抗原肽复合体可以引起特异性的细胞毒T淋巴细胞效应,应用这个特点可以设计抗病毒及抗肿瘤药物。但是gp96全长分子量大,蛋白在大肠杆菌中表达量低,不稳定,难纯化。组织提取的gp96又受组织来源和样品量的限制。对gp96的结构和功能的研究带来困难。克隆并表达了小鼠热休克蛋白gp96的羧基端560．751aa约四分之一长的功能片段,该段包含gp96的一个肽结合区和二聚化位点。将该功能片段在大肠杆菌中进行融合表达,纯化后将融合的片段切掉,并对目的片段进行了分析,结果表明该段可能是形成二聚体密切相关的片段,为进一步研究其结构和功能打下基础。     

热休克后表达受抑基因的分子克隆及其表达特性

以人成骨肉瘤细胞株ＨＯＳ－８６０３为热休克模型,在利用ＤＤｍＲＮＡ方法筛选和克隆了一个热休克后表达受抑基因的ｃＤＮＡ片段的基础上,以该片段为探针,筛选ＨＯＳ－８６０３细胞的ｃＤＮＡ文库,获得该基因的全长ｃＤＮＡ克隆（ＨＳＳＧ－１）;ＤＮＡ序列测定表明该ｃＤＮＡ全长１４５６ｂｐ,编码２７６个氨基酸,经计算机辅助分析,该ｃＤＮＡ序列尚未被报道。经ＲＮＡ斑点杂交证实,该基因的表达于多种组织细胞之中,并且     

甜椒细胞质小分子量热激蛋白基因(CaHSP18)的cDNA克隆与表达

用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的甜椒叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长779 bp的cDNA基因序列,包含一个480 bp开放阅读框,编码159个氨基酸.Southern杂交结果表明在甜椒基因组中有该基因的小的多基因家族.Northern结果显示该基因在甜椒根、茎、叶中的表达受热激和低温的诱导.原核表达分析表明该基因在高温以及低温条件下可以提高大肠杆菌的生存能力.     

甘蔗ScMOC1基因启动子的克隆与瞬时表达分析

MOC1属于植物特有的GRAS家族蛋白基因,是调控植物腋芽形成发育的关键基因。启动子对基因转录效率起直接调控作用,其功能分析可以精确定位基因的表达部位、发育阶段和调控机制,克隆甘蔗腋芽形成发育关键基因ScMOC1的启动子序列,研究其功能对该基因表达调控机制具有重要意义。本研究以我国主栽甘蔗品种新台糖22号(ROC22)的基因组DNA为模板,通过基因组步移和巢式PCR技术克隆到ScMOC1起始密码子ATG上游1874 bp的启动子序列。PlantCARE在线分析预测表明,该序列包含多个真核生物启动子必需的核心元件TATA-box、CAAT-box以及与光响应、激素响应和分生组织表达等相关的顺式作用元件,推测ScMOC1启动子可通过激素诱导调控ScMOC1表达,且该启动子可能通过分生组织表达顺式调控元件CAT-box参与ScMOC1对甘蔗分蘖的调控。将获得的启动子序列替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达进行活性分析,结果表明:本研究克隆的启动子片段能驱动GUS基因在甘蔗嫩叶中瞬时表达。5′缺失分析表明该启动子的基础启动子序列在起始密码子ATG上游350～500 bp之间。该结果为后续ScMOC1的调控机制研究奠定了良好的基础。     

植物热激蛋白的功能及其基因表达的调控

本文介绍了植物热激蛋白的产生、分布和分类。着重论述了热激反应的特点、植物热激蛋白的功能、热激基因表达与调控的研究进展     

人热激因子-1突变体hHSF190/2在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达及其活性研究

目的：在大肠杆菌和毕赤酵母中表达人热激因子（hHSF）-1突变体hHSF190/2,并对其活性进行研究。方法：利用分子克隆技术分别构建了hHSF190/2的原核表达质粒pET45b-hHSF190/2和真核表达质粒pPICZaA-hHSF190/2,分别转入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS和毕赤酵母GS115进行诱导表达;经纯化除去杂蛋白后,采用蛋白免疫印迹、电泳迁移率变动分析和蛋白转导等方法研究表达产物的功能和活性。结果：hHSF190/2在2个系统中均得到有效表达,都具有与热激元件（HSE）结合的活性,但真核表达产物与HSE的结合能力明显高于原核表达产物;原核及真核系统表达的hHSF190/2都能激发热激蛋白（HSP）70的表达,但真核表达的hHSF190/2活性更高。结论：hHSF190/2有望成为有治疗作用的蛋白药物。     

玉米pepc基因在杂交转育的转基因水稻后代中的传递和表达特征

在合肥、海南两地以高光效转玉米pepc基因水稻为父本,与培矮64S、2302S、2304S、2306S、5129、02428、皖粳97和双九A等8个受体杂交,转育转pepc基因水稻新种质材料。至2002年已转育成一批转pepc基因水稻品系,对这些材料世代跟踪研究显示：(1)玉米pepc基因以一个显性基因稳定传递给后代,符合孟德尔分离规律,自交F2呈3：1分离,BC1为1：1分离;(2)玉米pepc基因在杂交转育的转基因水稻中高水平表达,与受体亲本相比,PEPC活性提高3.7～17．4倍,表达水平与受体亲本和转基因拷贝数有关,来源相同的世代间有相似的表达水平,但同一世代不同个体间表达水平有差异,这可能与其位置效应、拷贝数和环境条件有关;(3)杂交后代结实率不高,容易产生异交结实导致转基因材料混杂分离。采取抗生素催芽初筛、PCR分析抽检、PEPC活性测定和田间表型观测的转玉米pepc基因水稻选育筛选体系,辅之以受体为轮回亲本适当回交可有效地控制。利用该途径已育成3个稳定的高表达的转玉米pepc基因水稻品系H1596、H1597和Y1470,说明通过常规杂交转育的方法,可以培育实用的稳定高表达的转玉米pepc基因水稻品种。     

甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达

以甘蓝型油菜‘德油五号’基因组DNA为模板,通过反向PCR扩增得到肌醇半乳糖苷合成酶基因（BnGOLS1）启动子片段,长度为827bp。PLACE和PlantCARE启动子预测工具分析表明：序列中含有TATA-Box、CAAT-Box等基本转录元件,以及ABRE、DRE、HSE、w-Box等顺式作用元件。将克隆得到的BnGOLS1启动子取代pBI121中的CaMV35S启动子,构建BnGOLS1启动子控制报告基因的GUS表达载体pBI-GS-GUS,通过农杆菌介导的方法在油菜组织中进行瞬时表达。GUS染色结果表明BnGOLS1启动子可以驱动GUS基因在油菜组织中的表达。     

柞蚕小热休克蛋白20.1的基因鉴定及免疫功能研究

热休克蛋白(HSP)是一类广泛存在于各类生物中的具有分子伴侣功能的蛋白质。近年来研究发现HSP与机体许多功能如免疫、凋亡、衰老等密切相关。柞蚕(Antheraea pernyi)小热休克蛋白20.1(Aphsp20.1)基因的开放读码框长度为534bp,编码178个氨基酸。序列比对结果表明,柞蚕小热休克蛋白20.1属于HSP20家族。组织定量显示这Aphsp20.1在中肠和脂肪体分布较高。此外用大肠杆菌Escherichia coli及Micrococcus luteus病原微生物注射入5龄3天柞蚕幼虫后,发现Aphsp20.1的基因表达菌明显上调。另外体外抑菌试验结果发现纯化后的蛋白也具有一定的抑菌作用。该研究表明ApHSP20.1在柞蚕的免疫功能中具有重要作用,该研究不仅为我们进一步了解更加复杂的高等生物天然免疫反应提供一些相关的研究线索;而且对柞蚕天然免疫的研究有利于更好地理解昆虫自身的免疫系统,为保护益虫防治害虫提供重要依据。     

柞蚕热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

HSP70蛋白是受热等因素刺激后而诱导产生的蛋白质,是热休克蛋白家族中最重要的一员。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)热休克蛋白70基因(HSP70)的ORF序列(GenBank登录号:GU945199),该片段的序列长度为1905bp。生物信息学分析表明,该序列共编码634个氨基酸,预测蛋白的等电点和分子量大小分别为5.62kD和69.5kD。具有HSP70的保守性结构特征,与天蚕(Antheraea yamamai)、家蚕(Bombyx mor)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、棉铃虫(Heliothis viriplaca)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、烟草夜蛾(Manduca sexta1)、膜翅目寄生蜂(Cotesia rubecula)的同源性分别为95.7%、78.5%、76.1%、77.3%、76.6%、74.7%、65.9%。根据它们的一级结构构建了系统进化树,进一步确立了它们之间的亲缘关系。     

Expression of the rice Osgrp1 promoter-Gus reporter gene is specifically associated with cell elongation/expansion and differentiation

To study the expression and regulation of a rice glycine-rich cell wall protein gene, Osgrpl, transgenic rice plants were regenerated that contain the Osgrpl promoter or its 5 deletions fused with the bacterial -glucuronidase (GUS) reporter gene. We report here a detailed histochemical analysis of the Osgrpl-Gus expression patterns in transgenic rice plants. In roots of transgenic rice plants, GUS expression was specifically located in cell elongation and differentiation regions, and no GUS expression was detectable in the apical meristem and the mature region. In shoots, GUS activity was expressed only in young leaves or in the growing basal parts of developing leaves, and little GUS activity was expressed in mature leaves or mature parts of developing leaves. In shoot apices, GUS activity was detected only in those leaf cells which were starting to expand and differentiate, and GUS expression was not detected in the apical meristem and the young meristematic leaf primordia. GUS activity was highly expressed in the young stem tissue, particularly in the developing vascular bundles and epidermis. Thus, the expression of the Osgrpl gene is closely associated with cell elongation/expansion during the post-mitotic cell differentiation process. The Osgrpl-Gus gene was also expressed in response to wounding and down-regulated by water-stress conditions in the elongation region of roots. Promoter deletion analysis indicates that both positive and negative mechanisms are involved in regulating the specific expression patterns. We propose a simple model for the developmental regulation of the Osgrpl gene expression.     

控制基因盐诱导且根系优势表达的小麦启动子Tasipro3克隆及功能分析

在土壤盐胁迫下,小麦根系吸收水分和营养物质的功能受到抑制,从而影响植株的经济产量。因而,开展小麦耐盐育种,提高根系耐盐性是重要途径之一。使耐盐基因在根系中优势表达,并且在盐胁迫下增强表达,将显著提高根系耐盐性。而克隆和鉴定具有双重控制功能的启动子,是实现耐盐基因精准调控的基础。鉴于此,本研究利用Genevestigator在线生物信息学分析软件,筛选到425个盐诱导根系优势表达的探针,并从中选出2个候选探针,用于启动子验证。以1周龄小麦品种中国春的幼苗为材料,将其根系置于200 mmol/L的NaCl溶液中,分别于0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h和8 h进行根系取样,用于表达模式分析。结果表明,Ta.5463.1.A1_at探针的基因表达模式更符合生物信息学预测的结果,受盐胁迫诱导表达显著上调,且基因优势表达于根系。为进一步验证相应基因启动子的功能,对此探针对应的启动子区进行了克隆,并连接到启动子验证载体中,遗传转化获得转基因拟南芥植株。盐诱导后GUS染色的实验结果表明,该启动子使GUS报告基因在盐处理下表达量显著提高,且主要在根系表达。本研究成功克隆了耐盐遗传改良专用启动子,为小麦分子抗逆育种提供了优异资源。     

大鼠部分肝切除前后热激处理对过氧化物酶基因表达的影响

用过氧化物酶原位复性电泳（SDS－POD－PAGE）技术分析了部分肝切除（partial hepatectomy,PH)、部分肝切除后再热激（partial hepatectomy following heat shock,PH-HS)和先热激再部分肝切除（heat shock following partial hepatectomy,HS-PH)后肝再生期间过氧化物酶（POD）基因表达差异,结果表明,PH中表达的POD基因种类（7个）＞PH－HS（5个）＞HS－PH（3个）;三个模型的POD总活性为：HS－PH＞PH－HS。根据实验结果推测,POD在肝再生和肝损伤恢复中起一定作用。