人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

目的：在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型（HPV6）L1的融合蛋白。方法：PCR方法扩增HPV6 L1,基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6mLI,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果：酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol／L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论：获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。     

噬藻体PaV-LD主要衣壳蛋白、穿孔素和内肽酶基因的克隆及表达分析

最近阐明了水华蓝藻噬藻体PaV-LD (Planktothrix agardhii Virus isolated from Lake Donghu)的全基因组序列, 这是一个含有142个ORF的双链DNA噬藻体。在此, 我们对其主要衣壳蛋白基因073R, 内肽酶和穿孔素基因123L-124L(PaV-LD基因组中两个相邻的ORF)进行了基因克隆与表达分析。将073R克隆后构建原核表达质粒pET-32a-073R, 并用IPTG进行诱导表达, 073R融合蛋白经纯化后, 进行免疫小鼠制备抗体; 通过Western blot检测经噬藻体感染宿主细胞后073R的表达时序, 结果显示在宿主细胞裂解之初, 即PaV-LD感染48h以后073R开始表达, 表明073R是一个晚期基因; 同时073R推导的氨基酸序列与34株噬藻(菌)体及2株藻病毒(感染真核藻的病毒)的主要衣壳蛋白的氨基酸序列进行序列比对, 显示073R与无尾的藻病毒衣壳蛋白亲缘关系更近。PCR扩增内肽酶和穿孔素基因123L-124L, 并构建质粒pOP123L-124L, 将其转入模式藻集胞藻PCC6803细胞中, 质粒pOP123L-124L与藻集胞藻PCC6803基因组发生重组, 形成重组藻; 测定了重组藻与野生藻的生长速率, 并绘制生长曲线; 制备超薄切片, 进一步比较和观察重组藻与野生藻的超微结构的变化。结果显示重组藻与野生藻存在生长速率与超微形态的显著差异。       

刚毛柽柳ThPP2C基因的克隆和表达分析

蛋白磷酸酶2C（PP2C）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在体内以单体形式存在,由它催化的可逆磷酸化反应是细胞信号转导的重要组成部分,这一过程几乎参与所有的生理和病理过程。本研究从柽柳中克隆获得一条PP2C基因,命名为ThPP2C。该基因开放读码框（ORF）长849 bp,编码282氨基酸,推测蛋白质分子量为30.54 kDa,理论等电点为7.13。qRT-PCR结果显示,0.4 mol·L^-1 NaCl、20%（w/v） PEG₆₀₀₀、150 μmol·L^-1 ABA和100 μmol·L^-1 JA胁迫处理后,ThPP2C基因在刚毛柽柳根和叶中的表达均发生了明显改变,但时空表达模式不完全相同。NaCl、ABA和JA处理后ThPP2C基因在叶中都表现为下调表达。而根中,NaCl和JA胁迫后主要表现为上调表达。ABA处理早期表达下调,随后表达量逐渐增加。与其他3种胁迫不同的是,PEG₆₀₀₀处理后ThPP2C基因在根中明显下调,而在叶中胁迫早期表现不明显,48 h后被高度诱导。表明ThPP2C基因可能参与了刚毛柽柳高盐、干旱以及激素处理的适应过程,但其功能还有待进一步验证。     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆和表达及鉴定

克隆人乳头瘤病毒6型(HPV-6)保护性抗原L1基因,构建L1基因表达载体。从临床诊断尖锐湿疣的病理组织标本中提取HPV-6的DNA,采用高保真PCR扩增其保护性抗原L1基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。构建pET32a的L1表达载体,在E.coliBL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE鉴定表达产物。所克隆的L1基因与报道的相应核苷酸序列同源性为99.20%~99.93%,氨基酸序列同源性高达99.80%~100%。SDS-PAGE结果显示,在构建的载体中成功表达预计大小分子量的融合蛋白,成功构建了HPV-6的保护性基因L1的表达系统。     

虹鳟mc1r基因的克隆、序列分析及在 不同发育阶段和组织的表达分析

黑素皮质素1受体基因(mc1r)是控制动物色素合成的重要基因,为探讨mc1r基因与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体色变异的关系,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得虹鳟mc1r基因的cDNA全长序列,并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在野生型虹鳟(虹鳟)和黄色突变型虹鳟(金鳟)体色发生不同时期(从受精期至12月龄)及成鱼背部皮肤、腹部皮肤、背部肌肉、腹部肌肉、眼、脑、鳃、中肾、头肾、肠、肝、脾和心13种组织中的表达差异。结果显示,mc1r基因序列全长为4 518 bp,开放阅读框1 017 bp,编码338个氨基酸。氨基酸序列分析发现,虹鳟Mc1r蛋白具有7TM_GPCR_Srsx结构域。通过氨基酸序列同源比对与系统进化分析表明,Mc1r蛋白序列在鱼类间具有较高的保守性。qRT-PCR结果表明,mc1r基因在虹鳟与金鳟的受精期就开始表达,且在受精期至桑葚期胚胎的表达量高于胚胎后期;mc1r基因在虹鳟与金鳟相同时期表达比较结果显示,该基因在受精期、4细胞期、16细胞期、囊胚期、原肠期、神经期、体节期、1日龄、3日龄、7日龄胚胎或个体以及1月龄、2月龄、3月龄和6月龄背部皮肤中的表达均差异显著(P 0.05);mc1r基因在12月龄虹鳟和金鳟的13种组织中均有表达,其中,该基因在虹鳟与金鳟的背部皮肤、腹部皮肤和脑中的表达量较高,显著高于其他组织(P 0.05),且虹鳟背部皮肤中该基因的表达量高于金鳟背部皮肤(P 0.05)。以上结果表明,mc1r基因可能与虹鳟体色变异密切相关。本研究可为后期进一步深入阐明虹鳟体色变异的分子机制提供基础资料。     

牦牛TGF-β2基因片段的克隆测序及系统进化分析

克隆测序了牦牛的TGF-β2基因,并进行了Blastn比较分析。结果表明,牦牛TGF-β2基因片段长为559bp,与普通牛、人、黑猩猩、小鼠的相应片段的同源性分别达98%、95%、94%、93%。在5′端调控区域没有类似TATA盒元件,推测TGF-β2基因在脾脏、肾脏组织细胞中表达量不是很高。由于TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用,牦牛TGF-β2基因研究对高原畜牧业发展提供了科学资料。     

人白细胞介素2受体β(IL-2RB)基因真核表达及与JAK1的相互作用的检测北大核心

[目的]构建含人白介素2受体β(IL-2RB)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-2RB-His,并在293T中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL-2RB在细胞内的相互作用。[方法]在Hela细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL-2RB的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR克隆,双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-2RB-His转染至293T细胞中。免疫印迹法检测不同时间点的IL2RΒ蛋白(24 h、36 h、48 h)在293T细胞中的表达,用免疫共沉淀检测JAK1和IL-2RB蛋白之间的相互作用。[结果]经PCR克隆、双酶切、测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见61 k Da的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-2RB的质粒,免疫印迹可见分别为133 k Da和61 k Da的目的条带。[结论]成功获得IL-2RB基因全长,成功构建p ENTER-IL-2RB-His真核表达质粒,并在293T细胞中成功表达,随着时间的推移其表达量增高。免疫共沉淀可以检测到JAK1和IL-2RB两者的蛋白相互作用,这为下一步研究JAK1和IL-2RB这一对蛋白的相互作用的作用方式及作用机制奠定了基础。     

水稻矮秆基因iga-1的序列变异和表达分析

该研究以水稻矮秆突变体cha-2为材料,对控制其表型性状的iga-1基因进行候选基因筛选,利用基因注释数据库对定位区间进行候选基因预测,通过ORF及其上下游调控区域的测序、序列比对及关键元件分析进行序列变异研究,半定量PCR检测目标基因的表达模式,明确其在基因序列、表达模式的变异,探讨其分子遗传调控机理。结果显示:(1)在隐性核基因iga-1精细定位基础上预测得到3个ORF,其中2个编码dnaJ分子伴侣(含有dnaJ结构域的蛋白),分别是LOC_Os05g26902和LOC_Os05g26926;另外1个为已克隆的水稻矮秆基因RGA1(LOC_Os05g26890)。(2)ORF序列分析表明矮秆突变体cha-2与野生型仅在RGA1基因座存在SNP变异,但未造成氨基酸编码的改变。(3)表达模式分析发现,矮秆突变体cha-2的RGA1基因在种子萌发期、二叶期、四叶期和分蘖期等4个发育时期均不表达,且在‘中花11’、‘石狩白茅’的遗传背景下稳定遗传,均显现出失活状态,初步确定RGA1为iga-1的候选基因。(4)对RGA1基因上游和下游调控转录关键区进行测序结果表明,突变体cha-2存在865bp的大片段缺失,包括第1外显子、部分第1内含子和转录起始上游区域。研究推断,突变体cha-2的矮秆基因iga-1正是没有活性的RGA1基因,其转录关键区域的大片段缺失,导致无法正常转录表达。     

人端粒结合蛋白TRF1的克隆、表达和抗体制备

利用RT-PCR技术,从HeLa细胞的cDNA文库中扩增到人端粒结合蛋白1(hTRF1)基因编码区序列,克隆至pUCm-T载体,测序正确后,构建带His₆-tag原核表达载体pET-28c-TRF1,经IPTG诱导表达的His₆-TRF1融合蛋白分子量约为65kD,Western-blot证实表达产物可特异地与TRF1抗体sc-6165结合。用Ni^2＋NTA胶亲和层析纯化可得到电泳均一的融合蛋白,免疫新西兰纯种大白兔,获得特异性好的多克隆抗体,该抗体可用于免疫荧光染色和Western-blot方法检测哺乳动物细胞内源性的TRF1分子。     

家鸽Caveolin-1基因全长cDNA的克隆、序列和组织表达分析

窖蛋白(Caveolin)是一类构成细胞膜上胞膜窖主要结构的标志蛋白,由Caveolin基因家族编码而成。Caveolin-1基因是Caveolin基因家族的成员之一。该实验采用RT-PCR与RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术成功地克隆了家鸽Caveolin-1基因的全长cDNA。该cDNA全长2605bp,包含537bp的完整编码区,编码178个氨基酸;分析发现家鸽Caveolin-1基因编码区与牛、家犬、鸡、褐家鼠等核苷酸同源性为80.1%～93.4%,氨基酸同源性高达85.4%～97.2%;半定量RT-PCR分析表明该基因在家鸽各种组织广泛表达,脂肪中表达量最高,各种肌肉中表达量次之,肝脏中表达量最低。此结果说明家鸽Caveolin-1基因可能与脂肪、肌肉中的某些代谢途径有关。     

Cloning,expression and genomic structure of a novel human GNB2L1 gene,which encodes a receptor of activated protein kinase C (RACK)*

During a large-scale screen of a human fetal brain cDNA library, a novel human gene GNB2L1 encoding a novel RACK (receptor of activated protein kinase C) protein was isolated and sequenced. The cDNA is 1142 bp long and has a predicted open reading frame encoding 316 aa. The predicted protein shows higher similarity to rat RACK1 and many RACK proteins of different organisms including Drosophila, C. elegans, mouse, rat, human, C. fasciculata, zebrafish, A. thaliana, S. cerevisiae and so on, suggesting it is conserved during evolution. The gene was mapped to human chromosome 5q35.3, the telomer position of chromosome 5q, in which the disease gene for early-onset primary congenital lymphedema was mapped. Also, 5q35.3 is a frequently reported location for cytogenetic and molecular abnormalities in renal cell carcinomas. The gene has 8 exons and 7 introns. It is expressed ubiquitously in many human tissues detected by northern blot analysis and RT-PCR.     

Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1, a new Annexin A7 interacting protein

We report for the first time that Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1 (RACK1) formed a complex with Annexin A7. Hca-F and Hca-P are a pair of syngeneic mouse hepatocarcinoma cell lines established and maintained in our laboratory. Our previous study showed that both Annexin A7 and RACK1 were expressed higher in Hca-F (lymph node metastasis >70%) than Hca-P (lymph node metastasis <30%). Suppression of Annexin A7 expression in Hca-F cells induced decreased migration and invasion ability. In this study, knockdown of RACK1 by RNA interference (RNAi) had the same impact on metastasis potential of Hca-F cells as Annexin A7 down-regulation. Furthermore, by co-immunoprecipitation and double immunofluorescence confocal imaging, we found that RACK1 was in complex with Annexin A7 in control cells, but not in the RACK1-down-regulated cells, indicating the abolishment of RACK1-Annexin A7 interaction in Hca-F cells by RACK1 RNAi. Taken together, these results suggest that RACK1-Annexin A7 interaction may be one of the means by which RACK1 and Annexin A7 influence the metastasis potential of mouse hepatocarcinoma cells in vitro.     

Two closely related human members of chitinase-like family, CHI3L1 and CHI3L2, activate ERK1/2 in 293 and U373 cells but have the different influence on cell proliferation

The activation of extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2) has been associated with specific outcomes. Sustained activation of ERK1/2 by nerve growth factor (NGF) is associated with translocation of ERKs to the nucleus of PC12 cells and precedes their differentiation into sympathetic-like neurons whereas transient activation by epidermal growth factor (EGF) leads to cell proliferation. It was demonstrated that different growth factors initiating the same cellular signaling pathways may lead to the different cell destiny, either to proliferation or to the inhibition of mitogenesis and apoptosis. Thus, further investigation on kinetic differences in activation of certain signal cascades in different cell types by biologically different agents are necessary for understanding the mechanisms as to how cells make a choice between proliferation and differentiation.It was reported that chitinase 3-like 1 (CHI3L1) protein promotes the growth of human synovial cells as well as skin and fetal lung fibroblasts similarly to insulin-like growth factor 1 (IGF1). Both are involved in mediating the mitogenic response through the signal-regulated kinases ERK1/2. In addition, CHI3L1 which is highly expressed in different tumors including glioblastomas possesses oncogenic properties. As we found earlier, chitinase 3-like 2 (CHI3L2) most closely related to human CHI3L1 also showed increased expression in glial tumors at both the RNA and protein levels and stimulated the activation of the MAPK pathway through phosphorylation of ERK1/2 in 293 and U87 MG cells. The work described here demonstrates the influence of CHI3L2 and CHI3L1 on the duration of MAPK cellular signaling and phosphorylated ERK1/2 translocation to the nucleus. In contrast to the activation of ERK1/2 phosphorylation by CHI3L1 that leads to a proliferative signal (similar to the EGF effect in PC12 cells), activation of ERK1/2 phosphorylation by CHI3L2 (similar to NGF) inhibits cell mitogenesis and proliferation.     

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。     

苋菜IRT1基因克隆、序列及表达分析

通过对镉超积累苋菜品种天星米铁转运蛋白基因( IRT1)的克隆、序列及表达分析,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础.依据同源克隆原理,通过RACE技术克隆苋菜IRT1基因及生物信息学方法分析基因序列结构和功能,Northern杂交研究基因表达.苋菜IRT1基因cDNA全长1135 bp,包含完整的阅读框,编码322个氨基酸.苋菜IRT1蛋白与已知铁转运蛋白相似性在53.70％-63.04％,具有铁转运蛋白典型的功能结构特征,即N端含有1个信号肽、氨基酸序列上具有完整的ZIP家族功能结构域( Pfam:Zip)和7个跨膜结构域(TMs).苋菜IRT1蛋白还具有1个COG0428超级家族(转运二价金属离子功能)、2个蛋白激酶C磷酸化位点和2个酪蛋白Ⅱ磷酸化位点.低铁胁迫时苋菜根中IRT1基因表达量增加,加镉处理没有改变IRT1基因表达量.因此,推断苋菜IRT1基因是ZIP家族的一员,具有转运二价金属离子功能,将基因在GenBank中注册,序列号为:GU363501,命名为AmIRT1.     

葡萄病程相关蛋白1基因的克隆和表达分析

以葡萄品种‘左优红’组培苗叶片为材料,利用同源克隆法获得其病程相关蛋白1基因VvPR1的cDNA全长序列。扩增片段大小为486bp,编码161个氨基酸,分子量17.5kDa,等电点PI=8.69,含有6个保守半胱氨酸,4个allergenV5/Tpx-1related保守结构域。VvPR1与多种植物PR1高度同源。实时定量PCR检测结果表明VvPR1在葡萄叶片中相对表达量最高;霜霉病菌、低温、盐和干旱胁迫均可显著诱导其表达;水杨酸、脱落酸、茉莉酸、一氧化氮、过氧化氢和硫化氢等亦可诱导其大量表达,据此推测,VvPR1参与了多种生物胁迫和非生物胁迫过程。     

苹果一个锌指蛋白基因的cDNA克隆及其表达特性分析

采集了处于营养生长向生殖行长转化期(6~8月)的红玉苹果(Malus domestica Borkh.)茎顶,构建了其cDNA文库,并从中分离得到了一个具有锌指结构的EST序列,又通过5`RACE的方法,从cDNA文库中找到了其上游779bp的cDNA片段.最后用PCR的方法获得了苹果锌指蛋白的全长cDNA,并命为MdZF1.该cDNA序列已在GenBank登录,登录号为AB116545.MdZF1的锌指结构域与玉米的开花转换基因ID1有高度同源性.通过对苹果不同组织、器官的Northem和RT-PCR分析表明MdZF1在根、茎、叶、顶芽以及花器官(萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊)中都有表达.Southern分析表明MdZF1的基因组中是以单拷贝存在的.     

苹果一个锌指蛋白基因的cDNA克隆及其表达特性分析(英文)

A cDNA library was created from stem apex tissue from Jonathan apples (Malus domestica Borkh.), harvested in June to August, during which the plant transitions from vegetative growth to reproductive growth. From this library, we isolated an expressed sequence tag (EST) sequence containing a zinc finger motif, using this sequence, a 779 bp cDNA fragment was obtained by using 5‘ RACE, and a final full-length cDNA encoding an apple zinc finger protein (named MdZF1; GenBank accession number AB116545) was obtained by further PCR. This zinc finger motif of MdZF1 has high homology with INOETERMINATE1 (ID1) gene from maize which seemed to be involved in the transition to flowering. Northern blot and RT-PCR analyses showed that the MdZF1 expressed in the root, stem, leaves, shoot apex and floral organs of the apple, with expression levels higher in root, stem, leaves and floral shoot apex than that in floral organs (sepals, petals, stamens and pistils). Genomic Southern analysis showed that there was a single copy gene in apple genome.     

我国地方品种萧山鸡白介素2基因的克隆和分子进化分析

鸡白介素细胞2（cIL-2）是新近确定的非哺乳动物类细胞因子。建立了体外诱导鸡IL－2的最佳条件,从ConA激活的脾脏T淋巴细胞中克隆了我国地方品种鸡（浙江萧山鸡）IL－2 cDNA。该基因全长737bp,编码143个氨基酸的前体蛋白质。其编码序列与已公布的3条鸡IL－2仅有1－5个氨基酸的差异,与火鸡的IL－2同源性高达69.4%,与其他哺乳动物IL－2的同源性在21.2%－29.4%之间。二级结构预测表明,N端存在一长22个氨基酸的前导肽,4个关胱氨酸形成两个链内二硫键,并存在类似人IL－2的4个α螺旋,这些结构在维持IL－2生物学活性中起到重要作用。另外D^40、Y^65、E^82、N^108和Q^142等 在酸可能参与鸡IL－2受体的结合。分子系统进货树分析表明,鸡IL－2和哺乳动物IL－2有着共同的祖先;在免疫系统选择性压力下,形成独特的种族特异性。