甲醛对DNA损伤的彗星实验研究

甲醛是一种遗传毒性物质。国内外学者的大量研究证实,甲醛可以引起DNA-DNA、DNA-蛋白质分子交联,但对于甲醛是否能够引起DNA分子的断裂,学界却存在分歧。本实验以颊黏膜细胞作为实验材料,通过彗星实验对甲醛的遗传毒性——尤其是DNA分子断裂作用进行了系统的研究。结果显示甲醛在较低浓度(5μmol／L,7,5μmol／L,10μmol／L)时具有断裂作用,在较高浓度(15μmol／L,30μmol／L,50μmol／L)时则具有交联作用。根据本实验的结果,本文还首次论证了甲醛断裂作用的断裂峰值(7．5μmol／L)。     

用单细胞凝胶电泳技术检测粉纹夜蛾5BI细胞DNA损伤的研究

为了探测昆虫细胞的DNA损伤,本实验应用单细胞凝胶电泳技术,对不同剂量的过氧化氢和甲醛引起的粉纹夜蛾5BI细胞DNA损伤效应进行了研究,结果表明59μM=10μM、150μM的过氧化氢能引起粉纹夜蛾5BI细胞的DNA断裂,且断裂程度和浓度水平之间成正相关关系;10μM、30μM、50μM的甲醛能引起粉纹夜蛾5BI细胞DNA损伤,其中在10μM时引起DNA断裂,在30μM、50μM时引起DNA交联。     

甲醛致酵母菌与大肠杆菌DNA-蛋白质交联作用的比较

为了探讨甲醛致真核生物与原核生物DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslinks,DPC)的作用,以毕赤酵母(Pichia pastoris)和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α为材料,采用KCl-SDS沉淀法检测液态甲醛染毒后酵母菌与大肠杆菌中DPC含量。结果表明,低浓度(25μmol/L)甲醛不能引起酵母菌和大肠杆菌的DPC(P>0.05),而较高浓度(125和625μmol/L)甲醛可引起酵母菌和大肠杆菌明显的DPC(P<0.05);另外,酵母菌的DPC系数是大肠杆菌的DPC系数的10倍左右。这表明甲醛致真核细胞和原核细胞的DPC作用具有剂量效应关系,而且真核细胞的DPC系数比原核细胞的DPC系数更高。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化

目的:为了对银杏进行分子鉴定和遗传关系的分析,建立银杏ISSR-PCR的最佳扩增反应体系。方法:采用正交设计和单因素梯度实验,对影响ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、dNTP、引物、模板DNA及Taq DNA聚合酶)进行筛选及优化。结果:银杏25μL ISSR最佳扩增反应体系包含10×Taq反应缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2、0.45 mmol/L dNTP、1.2μmol/L引物(UBC861)、10 ng模板DNA及0.9 U Taq DNA聚合酶,使用此ISSR扩增反应体系,获得了10株不同性别银杏DNA的清晰条带,验证了该体系的稳定性。结论:优化的反应体系为采用ISSR分子标记技术对银杏进行遗传多样性分析、遗传育种和转基因等研究奠定了一定的理论基础。     

均匀设计优化毛竹EST-SSR PCR反应体系

本研究以毛竹叶片DNA为模板,利用均匀设计U10(54)表,对毛竹EST-SSRPCR反应体系的TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs及引物浓度4因素5个水平进行优化筛选。优化实验结果表明,毛竹EST-SSRPCR的25μL优化反应体系为:10×PCRBuffer(含Mg2+)2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5U,Mg2+、dNTPs及引物的最适浓度分别是1.0mmol/L、0.1mmol/L、0.48μmol/L;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为52.4℃。对优化出的EST-SSRPCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰可辨的DNA谱带。该优化体系为利用EST-SSR分子标记对毛竹进行遗传多样性等相关研究工作提供了基础条件。     

酥瓜(Cucumis melo var. conomon Group)基因组DNA提取及RAPD分子标记反应体系的建立

本研究以改良的CTAB法提取酥瓜基因组DNA,利用正交设计L_(16)(4~5),对酥瓜RAPD-PCR反应体系的5个影响因素(引物,dNTPs,Taq DNA聚合酶,Mg~(2+)和模板DNA)在4个水平上进行优化试验,并在30~50℃范围内摸索退火温度,建立适合酥瓜RAPD-PCR反应体系。研究表明,在25μL反应体系中,含有引物0.8μmol/L、dNTPs 0.3μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、Mg~(2+)0.5 mmol/L、DNA模板30 ng为最佳反应体系,RAPD-PCR扩增程序中最佳退火温度为37.6℃。该体系有助于酥瓜种质资源的遗传多样性分析评价。     

丹参SRAP反应体系的建立与优化

相关序列扩增多态性(SRAP)是一种新发展起来的分子标记技术.实验以丹参总DNA为模板,对SRAP-PCR反应体系的重要参数设置梯度实验,筛选最佳的SRAP-PCR反应条件.经过大量重复性实验,建立了一套适用于丹参稳定可靠、重复性好、带型清晰的SRAP-PCR反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量40ng、2.5mmol/L Mg2 浓度、0.8μmol/L的上下游引物、200μmol/L的dNTPs以及Taq酶1U.研究结果表明,该体系可应用于丹参植物种质的分类鉴别,并为其地道性及功能基因的研究奠定基础.     

辣椒素对离体大鼠胃平滑肌收缩性的影响

目的:考察辣椒素对离体大鼠胃平滑肌收缩性的影响。方法:本研究以大鼠的离体胃平滑肌条为模型,首先考察在正常钙克氏液、高钙克氏液和低钙克氏液中辣椒素对胃平滑肌收缩作用的影响。然后正常克氏液中,分别观察辣椒素对乙酰胆碱、新斯的明、阿托品分别存在下的胃平滑肌收缩性的影响。结果:辣椒素在2.5μmol/L-40μmol/L浓度范围内可剂量依赖性显著抑制高钙溶液(Ca2 终浓度5μmol/L)引起的大鼠胃平滑肌强烈收缩,在5μmol/L-40μmol/L浓度范围内可显著抑制正常克氏液中大鼠胃平滑肌条的运动,且具有明显剂量依赖性,在10μmol/L-40μmol/L浓度范围内可显著抑制低钙克氏液中大鼠胃平滑肌条的运动,且具有剂量依赖性。辣椒素(10μmol/L)可拮抗乙酰胆碱和新斯的明引起的收缩作用(P<0.01)。辣椒素(10μmol/L)的作用与阿托品具有相加作用(P<0.01)。结论:辣椒素对胃平滑肌的收缩具有明显的抑制作用。     

罗汉果SRAP反应体系的建立与优化

建立适合罗汉果的SRAP-PCR扩增体系,为罗汉果的遗传图谱构建及基因定位奠定基础。实验对罗汉果SRAP-PCR反应体系的影响因素(引物,dNTP,Taq酶,Mg~(2+),模板DNA)在多个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了罗汉果SRAP-PCR反应的最佳体系(10μL):引物0.6μmol/L、dNTP0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、Mg~(2+)2.0 mmol/L和模板DNA 30 ng。该体系的建立能很好的满足罗汉果基因组DNA的扩增要求,SRAP标记应用于罗汉果遗传研究是可行的。     

红树植物木榄SCoT-PCR体系优化及遗传多样性分析

为优化建立木榄的SCo T-PCR体系,利用建立的SCo T方法进行分析木榄不同地理种源的遗传多样性,基于L25(56)正交设计,本研究在5个水平上优化试验了5个影响木榄SCo T-PCR的因素:模板DNA、Mg~(2+)、d NTPs、Taq酶和引物。同时,运用优化的SCo T体系对木榄8个不同地理种源进行遗传多样性分析。本研究结果建立了木榄SCo T-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 20 ng,引物0.75μmol/L,d NTPs 0.5 mmol/L,Mg~(2+)2.5 mmol/L,Taq酶1.25 U。同时,筛选出了带谱清晰、多态性丰富的16条SCo T引物进行遗传多样性分析。共扩增出115个位点,其中73个为多态性位点,多态性比例为62.33%。从UPGMA聚类和PCo A分析结果可以看出8个地理种源间的遗传多样性及亲缘关系。研究表明SCo T分子标记可以用于木榄种群的遗传多样性。     

文昌鱼profilin同源基因的胚胎发育表达图式

本研究利用胚胎整体原位杂交技术结合系列组织学切片技术,以及Northern blot 分析,对进化上处于特殊地位的模式动物文昌鱼profilin 基因不同发育时期的表达图式进行了系统研究,揭示了该基因的动态表达图式与肌肉分化的过程一致,文昌鱼profilin 基因可能与胚胎早期肌肉的发育相关。同时,通过Southern blot 检测对青岛文昌鱼profilin 基因可能存在的同源体进行了探讨,试图为弄清文昌鱼肌肉发育分化的分子机制提供资料。     

蒜鳞片休眠进程中胞间联络的变化及类外连丝结构与功能的研究

利用电子显微镜术,对蒜休眠进程中鳞片薄壁细胞间胞间联络的特征进行了实验观察,发现不同时期胞间联络具有随细胞间生理关系密切程度而呈现相应结构变化的特点。并观察到萌芽期鳞片中衰败细胞与存活细胞之间有类外连丝型胞间连丝的存在;以激光共聚焦荧光显微镜结合荧光标记物示踪检测,发现不透膜荧光物质分子量为457Da 的萤黄(Lucifer yellow,LYCH),可以共质体运输方式进入存活细胞内,论证了类外连丝这一胞间连丝特定修饰态的存在,并可在一段时间内继续保持生理活性,起到进行物质共质运输的功能。     

酒精对γ-氨基丁酸转运蛋白Ⅰ(GAT1)功能调节方式的初步研究

已有报道GABA能系统参与酒精耐受和成瘾。我们实验室先前的研究表明急性和慢性酒精处理能快速增强小鼠中枢神经系统γ-氨基丁酸转运蛋白(GATs)的功能,但不影响中枢神经系统GAT1的基因表达水平;GABA 转运蛋白对底物的亲和性也未发生变化在本文中,我们用免疫荧光实验发现酒精处理后,GAT1蛋白向突触体质膜一侧聚集。蛋白磷酸化检测实验显示突触体内GAT1蛋白上丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸的磷酸化水平降低。这些结果提示酒精通过刺激GAT1蛋白从胞内转位到突触质膜上而提高GABA 重摄取的功能,GAT1蛋白去磷酸化可能在此过程中发挥了重要作用。     

超声波辅助农杆菌介导CP基因转化番小瓜(Carioca papaya L.)的有效方法

本研究探索了通过农杆菌介导,超声波辅助处理,转化番木瓜胚性愈伤组织,获得转基因植株的有效方法。分别将含有日本PLDMV 外壳蛋白基因(PTi-Epj-TL-PLDMV)和含有台湾PRSV 菌株、美国夏威夷PRSV 菌株、泰国PRSV 菌株及日本PLDMV 菌株的多元外壳蛋白基因编码序列(PTi-NP-YKT)插入双元载体质粒pGA482G,借助于农杆菌系LBA4404将双元载体上的外壳蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)转移到番木瓜品种Sunset 的胚性愈伤组织中,从而获得抗卡那霉素的转化再生植株。试验着重在转化方法上进行探索。结果表明,农杆菌过夜培养后,用高渗透压培养液(1/2 MS 6%蔗糖 1%葡萄糖,pH 5.7)调整至光密度OD_(600(?)m)=0.15-0.20,然后用该菌液感染材料30min,其间辅以超声波处理,可以大大提高转化效率。用15ml 无菌离心管装载胚性愈伤材料进行15s 的超声波处理,在80块被转化的胚性愈伤中获得21个CP 基因G 转化系(26.3%),而在对照处理64块胚性愈伤中仅获得1个转化系(1.6%);在经过15s 的超声波处理48块被转化的胚性愈伤中获得8个CP 基因B 转化系(16.7%),而在对照处理25块胚性愈伤中未出现转化系。上述操作方法用在两种CP 基因转化上均表现出相似的效果。试验还表明:120mg/L 是卡那霉素抗性筛选的最佳浓度。抗性筛选9个月后,在421块胚性愈伤组织中产生了42个抗卡那霉素的转化系。所获得的转基因植株分别用PCR 和Southern 印迹杂交进行了鉴定。     

小麦与叶锈菌互作过程中细胞程序性死亡的生化证据(简报)

细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)是一种受基冈调控的、主动的、连续的程序化反应一般发生程序性死亡的细胞具有较为典型的形态及生化特征:细胞收缩、核染色质浓缩、趋边化;DNA 在一定位点被核酸内切酶降解成以180bp 为     

水稻胚胎发育与萌发过程中凝集素的生物合成及其对转录与翻译抑制剂的敏感性

稻胚凝集素(RGL)在开花后7—13天之间合成活性很强,15天以后明显下降。7—13天之间RGL合成相当旺盛是由于这一时期编码RGL的mRNA得到迅速转录,而在开花后15—30天之间以及萌发4小时内RGL的合成主要是由胚分化发育期间(7—13天)所形成的mRNA所指导的。RGL主要在水稻胚胎发育过程中合成、积累,在萌发过程中几乎不表达,所以RGL是胚胎特异的蛋白质。     

白菜细胞核雄性不育花药的细胞化学观察

对一种由一对隐性基因控制的白菜细胞核雄性不育和可育株的花药进行了细胞学和组织化学研究。种子播种后,有1/4植株为不育株,其余的为可育株。通过对不育株和可育株花药发育的细胞学观察,确认不育花粉的败育发生在小孢子发育时期。用组织化学的方法研究了可育株和不育株花药发育过程中的多糖和脂类的分布动态,发现在减数分裂前,可育花药和不育花药的药隔细胞中都储藏了大量的淀粉粒。二者的差异仅是不育花药的绒毡层细胞液泡化明显。在减数分裂后的小孢子发育时期,可育花药的绒毡层细胞具有将药隔细胞中的淀粉粒多糖吸收并转化成脂类的功能,小孢子及以后的二胞花粉中也积累了大量的脂类储藏物质在不育花药中,虽然减数分裂后药隔细胞中的淀粉粒也都消失,但绒毡层细胞中的脂类物质相比很少,同时绒毡层细胞显示了明显的多糖反应,表明不育花药的绒毡层细胞将糖类转化为脂类的功能受阻。在小孢子的表面有些脂类物质,但在细胞质中却没有脂类积累。这一结果暗示在该种白菜细胞核雄性不育株中,由于花药绒毡层细胞转换多糖为脂类的功能失常,导致了小孢子的败育。     

稻曲病菌毒素的活性测定、抗体制备与细胞定位

稻曲病菌在PD 液体培养基中生长良好,并能产生对植物细胞具有高度生物抑制活性的毒素。生物学活性测定袁明,用100%的甲醇能提取稻曲病菌液体培养物中的粗毒素。粗毒素对小麦胚根胚芽的生长有强烈的抑制作用。把毒素主要成分Ustiloxin A 和BSA 偶联后,制备了抗血清,ELISA 检测表明用两种偶联剂偶联所制备的抗体效价分别为1∶20000和1∶6000。进一步的免疫胶体金标记分析表明,所制备的抗体能与茼丝中分泌的毒素特异性结合,说明所获得的抗体是特异性的。     

马铃薯转化酶抑制子St-inh cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达和功能测定

用RT-PCR结合5’RACE方法从马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inh 全长cDNA。序列分析表明,St-inh 基因编码区全长663bp,编码221个氨基酸。将含St-inh 基因cDNA 的DNA 片段克隆到pET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功实现了表达。基因表达产物与马铃薯栽培品种(系)E1、JH 试管块茎以及番茄果实的转化酶提取物共孵育结果显示,转化酶活性分别下降了34.3%、21%和33.8%,说明St-inh 的翻译产物具有转化酶抑制子功能。BLAST 基因序列分析表明,St-inh 与Kunitz-type C 类基因序列同源性达95%以上,T-COF-FEE 氨基酸序列对比分析显示,该基因编码的蛋白质具有典型的Kunitz-type 结构域[L,I,V,M]-X-D-X-[E,D,N,T,Y]-[D,G]-[R,K,H,D,E,N,Q]-X-[L,I,V,M]-X(5)-Y-X-[L,I,V,M],因此,Sit-inh 基因可能为Kunitz-type 家族成员。     

人谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTp)中半胱氨酸对其在细胞氧化应激下功能的影响

利用PCR定点突变技术构建人GSTp三种半胱氨酸突变体C~(47/101)、C~(14/47/101)和C~(14/47/101/169)。将CSTp 野生型和突变体表达质粒转染293细胞,以CDNB 为底物测定胞内GST 的转移酶活性,结果显示各类突变体均明显抑制了细胞内源性CST 的催化活性,具有显著的负显性(dominant nega-tive)突变体的功能;将CSTp 野生型和突变体与c-Jun、NF-kB 和p53的报告基因载体共转染,通过萤光素酶活性测定发现突变体C~(14/47/101)和C~(14/47/101/169)能明显激活c-Jun 和p21的转录活性;Western印迹分析显示突变体均能上调细胞内p21蛋白的水平,细胞存活率的测定表明GSTp 突变体能增强293细胞对H_2O_2刺激的敏感性;实验结果表明半胱氨酸残基对于维持GSTp 在对抗细胞氧化应激过程中的保护作用至关重要。