东方田鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的对影响东方田鼠胚胎成纤维细胞（MfEF）分离和培养的因素进行探索,并观察其生物学特性。方法取室内繁殖饲养不同胎龄的东方田鼠胚胎分离成纤维细胞,通过原代和继代培养,分析比较不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度等因素对MfEF分离及培养的影响,观察MfEF的生长形态及其生物学特性。结果 MfEF为贴壁型生长,细胞形态多样,呈梭形、不规则多边形;采用0.125%的胰蛋白酶室温消化12～13 d胚胎组织5 min,以DMEM培养基添加15%小牛血清分离培养MfEF的效果最佳;MfEF2～7代增殖最旺盛。结论获得了实验室分离、培养MfEF的有效方法 ,为进一步深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定了基础。     

用于克隆的猕猴耳成纤维细胞的培养及其有关生物学特性

应用组织块培养法成功地分离培养了猕猴耳皮肤成纤维细胞。对培养细胞进行了形态观察、生长曲线测定、免疫细胞化学分析、染色体和周期分析,结果表明培养的细胞具有正常的大小、形态、细胞骨架系统和染色体数目,而且随着细胞汇合程度的增加,G0／G1期细胞所占的比例上升,70％-80％和90％-100％两种汇合程度的G0/G1期和S期比例间存在明显的差异(P<0.05)。对培养猕猴耳成纤维细胞的有关生物学特性进行分析,有利于给同种和异种体细胞克隆猴研究提供形态良好、染色体数目正常的供体细胞,同时也为体细胞转基因等其他领域的研究提供了基础条件。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果 0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显;DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代。并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色。结果倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性。结论建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞。     

水牛皮肤成纤维细胞的分离与体外培养

探讨水牛成纤维细胞的分离与传代培养方法。组织块培养法培养的成纤维细胞原代生长较慢,需12天左右方可汇合形成单层,而酶消化法培养的成纤维细胞原代生长相对生长快,仅需8天便可汇合形成单层。两种方法传代细胞的生长速度相似,仅需4-5天就可汇合形成单层。通过体细胞的核型分析发现,成纤维细胞在传代培养过程中的核型变化不大,66．67％～81．67％的细胞具有正常的二倍体核型,各代之间无显著差异。结果表明,水牛成纤维细胞均能稳定地进行传代培养。     

中华鼢鼠成纤维细胞长期培养及其生物学特性分析

中华鼢鼠(Eospalax fontanierii)为蒙古高原代表性动物遗传资源,本研究采集中华鼢鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉、气管、剑状软骨和尾尖皮肤共9种组织用于实验,其中气管、肺和剑状软骨3种组织成功建立成纤维细胞系,传了8代,并分析了这些细胞的生物学特性。主要实验方法是通过细胞计数法计算细胞的贴壁率、冻存前及复苏后的存活率、绘制细胞生长曲线;制备常规染色体标本分析染色体核型。实验结果显示,中华鼢鼠气管、肺、软骨3种组织在体外条件下培养,第3～4天出现成纤维样细胞,原代细胞分别在培养第11天、第16天、第17天,达到90%以上汇合。3种组织来源体细胞均显示成纤维细胞特征,气管成纤维细胞贴壁能力最强,24 h贴壁率最高能达到98.10%,肺成纤维细胞与剑状软骨成纤维细胞贴壁能力较弱,24 h贴壁率最高,分别为95.28%和94.88%。3种来源成纤维细胞生长曲线测定结果显示,气管成纤维细胞的增殖能力最强、肺成纤维细胞次之、剑状软骨成纤维细胞最弱。气管成纤维细胞和肺成纤维细胞在接种后的第6～7天,进入对数生长期。剑状软骨成纤维细胞在接种后第2～3天进入对数生长期。3种成纤维细胞的生长曲线均呈\"S\"型,其中气管成纤维细胞增殖能力最强,在24孔板的每个孔中,其最大增殖数目为2.435×10~4个,肺成纤维细胞最大增殖数目为1.813×10~4个,剑状软骨成纤维细胞最大增殖数目为1.521×10~4个。核型分析结果显示,中华鼢鼠的成纤维细胞染色体数目为2n=62,30对为常染色体,1对为性染色体。综上所述,本研究成功建立了中华鼢鼠成纤维细胞体外培养体系,并揭示了该物种成纤维细胞的基本生物学特性,为深入研究中华鼢鼠适应低氧高二氧化碳洞道生境的分子生物学和生理学机制提供了条件,为进一步研究其遗传及物种进化提供了实验材料和参考。     

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系.方法:取不同胎龄的小鼠分离原代胚胎成纤维细胞,观察不同胎龄小鼠对分离和培养效果的影响.结果:从不同胎龄小鼠均分离得到胚胎成纤维细胞,但最佳分离时间为13.5～14.5 d;传代时在室温下消化单层贴壁细胞可随时控制消化时间,效果良好.结论:从13.5～15.5 d胎龄小鼠胚胎分离培养胚胎成纤维细胞效果最佳.     

Hartley豚鼠耳朵成纤维细胞分离培养与鉴定分析

本文旨在建立快速获取豚鼠耳朵成纤维细胞的方法,为豚鼠体细胞重编程技术提供起始细胞。首先采用0.05%Trypsin-EDTA和Collagenase IV两种消化酶对脱毛后的耳朵组织碎块进行消化;然后对获取的细胞进行体外培养和形态学观察,支原体检测,Vimentin蛋白免疫荧光鉴定,测定细胞生长曲线计算细胞倍增时间;用绿色荧光蛋白的逆转录病毒感染后用流式细胞仪检测感染效率,核型鉴定检测病毒对核型的影响。分离的豚鼠耳朵成纤维细胞为贴壁生长细胞,消化后2~3h即大部分贴壁并基本完全伸展,细胞呈梭形或多角形,胞浆饱满,立体感强,细胞核清晰形态良好,支原体检测阴性。细胞表达成纤维细胞特异性蛋白Vimentin。生长曲线为S形,符合体外培养细胞正常生长增殖规律,细胞倍增时间为24.85h。逆转录病毒感染效率达75.6%,病毒感染后染色体2n=64的细胞占90%,遗传稳定核型正常。本研究提供的体细胞获取方法操作简单,效率高,获取的细胞状态良好,细胞增殖速度快,细胞感染率高,是一种非常合适的豚鼠耳朵成纤维细胞分离手段,为后续进一步研究豚鼠体细胞重编程提供了技术基础。     

牛肝干细胞的分离培养与鉴定

该实验旨在分离牛肝干细胞,培养观察其生长特性,为比较医学研究及开发牛肝脏体外研究工具提供实验基础。实验采用改良的离体两步胶原酶灌流法,结合密度梯度离心分离牛肝干细胞,观察细胞形态及生长特性,并利用免疫荧光染色和PCR对牛肝干细胞相关标志物进行鉴定。实验分离的细胞接种48 h开始贴壁分裂,随后呈集落样生长,表现出干细胞的特性,低密度下培养504 h后细胞呈肝细胞样分化。正常接种密度的细胞可传至P3代,HE染色可见细胞均为单核,核浆比大,呈幼稚低分化状态;免疫荧光染色和PCR结果均显示,该细胞表达甲胎蛋白AFP、上皮细胞黏附蛋白(EpCAM)、造血干/祖细胞表面标志CD34、干细胞因子受体蛋白(c-kit)、细胞角蛋白CK18、CK19。结果表明,该研究分离了一种具有明显干细胞特征,并表达成熟肝细胞和胆管上皮细胞表面标志物的牛肝干细胞。     

大鼠精原干细胞的微滴培养法

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）作为成体干细胞的一类,既具有自我更新和分化的潜能,又可向子代传递遗传信息。阐明其增殖过程及分化特性对SSCs的进一步应用具有重要意义。小鼠SSCs的微滴培养研究显示,微滴培养技术与常规培养方法相比具有独特的优势。然而其他物种的SSCs能否实现微滴培养尚有待证实。该研究旨在利用微滴培养法建立大鼠SSCs体外培养技术。5、8、10、20、40个大鼠SSCs分别置于20此微滴中培养,用丝裂霉素处理的STO细胞作为滋养层。倒置显微镜观察记录大鼠SSCs的增殖状态。一个月后,对微滴培养的SSCs进行免疫荧光双标记染色鉴定。结果显示,一个微滴内接种5个SSCs就能实现扩增培养;培养一个月后,SSC仍然表达其特异的标记基因分子如CDH1、OCT4、PLZF、Thy1和Gfra1。体外诱导分析显示,微滴培养的大鼠SSCs具有分化为精母细胞的能力。大鼠SSCs微滴培养法的建立,为其他物种SSCs的培养提供了借鉴,也为再生医学和生命科学相关领域的研究提供了技术平台。     

成年大鼠嗅鞘细胞与嗅觉神经成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的 建立一种原代提取嗅鞘细胞与嗅觉神经成纤维细胞混合培养的方法.方法 自2.5月龄SD大鼠嗅球最外两层分离嗅鞘细胞和嗅觉神经成纤维细胞进行混合培养,并不进行纯化,分别于7 d、10 d、14 d行免疫细胞化学鉴定,并计算各个时间点嗅鞘细胞的纯度.结果 体外培养的嗅鞘细胞主要呈两极或多极状,而嗅觉神经成纤维细胞则成扁平的像成纤维细胞的形态,免疫细胞化学结果显示嗅鞘细胞呈p75 NGFR阳性,嗅觉神经成纤维细胞呈fibronectin阳性,两种细胞都呈vimentin阳性,在7 d、10 d、14 d各个时间点嗅鞘细胞分别占混合培养的34.1%、25.6%、8.6%.结论 从成年大鼠嗅球最外两层分离的培养中主要包含嗅鞘细胞和嗅觉神经成纤维细胞,嗅鞘细胞在混合培养中所占的比例随培养时间的延长而逐渐降低.     

人胸膜间皮细胞的分离和培养

利用两种取材方法建立人胸膜间皮细胞(HPMC)体外培养模型,一是用胰蛋白酶-EDTA消化法,从人肺脏胸膜及壁胸膜上分离胸膜间皮细胞;二是从胸腔积液中分离胸膜间皮细胞;进行胸膜间皮细胞的培养。用形态学和免疫组化S-P法对培养所得细胞进行鉴定。光镜下可见细胞汇合后呈多角形铺路石样,电镜下可见丰富的微绒毛和内质网,免疫组化染色结果显示表达角蛋白、波形蛋白,而抗VIII因子相关单克隆抗体、抗人白细胞CD45表达阴性;证实为人的胸膜间皮细胞。两种取材方法均可以成功建立间皮细胞体外培养模型,方法学上均有可行性;手术标本所得细胞有较高的细胞纯度,取材上胸腔积液更易于得到。     

自发性高血压大鼠血管平滑肌及心肌内成纤维细胞生长特性的研究

目的　探讨自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)主动脉平滑肌细胞(aorta smooth muscle cell, ASMC)与心肌内成纤维细胞(cardiac fibroblast, CFB)在体外培养生长的特性。方法　16周龄自发性高血压大鼠(SHR)和正常大鼠(WKY)测血压后处死,取心脏与胸主动脉,组织块法分别培养CFB与ASMC)。分别观察(1)CFB     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的建立一种从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞（MSCs）的高效方法。方法采取贴壁细胞分离法分离和纯化小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）,检测mMSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化能力,用流式细胞术及显微镜分别检测mMSCs纯度和形态特征。结果mMSCs贴壁生长后形态较均一,细胞形态呈成纤维细胞样,流式细胞术检测：CD45、CD11b、CD44及CD29分别为（3.34）%、（2.41）%、（98.46）%及（99.36）%。第4代mMSCs经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论通过贴壁培养可以从小鼠骨髓中分离培养出高纯度mMSCs,该方法效率高,稳定性好。     

人羊水来源干细胞的体外培养及其生物学性状分析

目的:体外分离培养人羊水来源干细胞(hAFSC),观察分析其基本的生物学性状。方法:取孕中期产前诊断所抽取的羊水,离心收集细胞,然后贴壁培养获得hAFSC。在细胞培养的基础上,观察hAFSC的形态;研究其增殖能力;用流式细胞术测定细胞周期及不同代次细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)表达率的变化;利用RT-PCR方法检测细胞干性基因的表达;利用诱导培养基诱导,检测其向肝样细胞与成骨细胞分化的潜能。结果:在体外培养条件下,hAFSC表现为成纤维细胞形态;具有良好的增殖能力,群体倍增时间约为36 h;细胞周期检测G0/G1期细胞约占86.7%,S+G2/M期细胞约占13.3%;流式细胞术检测结果表明,hAFSC表达SSEA-4,且SSEA-4阳性率随传代次数呈现先上升后下降的趋势;hAFSC在mRNA水平上表达Nanog、Oct4和Rex1等胚胎干细胞标志性基因;经诱导培养基诱导后,hAFSC可以向肝样细胞与成骨细胞分化。结论:hAFSC是一群呈成纤维细胞样,有良好增殖能力,且具有多向分化潜能的细胞,加之其来源方便,伦理学限制较少,因此在细胞治疗及组织工程等方面有着广泛的应用前景。     

人脐静脉间充质干细胞的分离培养及生物学特性鉴定

为了对人脐静脉间充质干细胞(MSC)进行分离培养及其生物学特性鉴定。采用胶原酶分步消化法获得人脐静脉间充质干细胞(hUVMSC2)并对其进行体外培养、形态学观察及绘制生长曲线;利用条件培养基诱导法分析该细胞分别向成骨细胞和脂肪细胞分化能力;流式细胞术检测细胞表面标志物CD54、CD105、CD29、CD166、CD44、CD31、CD34、CD49、CD106等表达情况。结果该细胞形态为梭形或成纤维样,不表达内皮来源的vWF因子。在不同诱导条件下,该细胞可分别向成骨细胞和脂肪细胞分化。hUVMSC2细胞表面表达CD54、CD105、CD29、CD166、CD44等间质细胞黏附分子,不表达CD31、CD34、CD49、CD106等内皮或造血细胞相关标志物。该细胞指数生长期倍增时间约为26h,在添加bFGF条件下可迅速增殖,指数生长期倍增时间缩短为16h。研究证实人脐静脉内皮层下存在间充质干细胞,采用分步酶消化法可同时分别获得单根脐静脉的内皮细胞和间充质干细胞。hUVMSC2间充质干细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞分化潜能并表达多种黏附分子。