两个国内小型猪品种GH基因部分序列的多态性分析

目的对西藏小型猪和广西巴马小型猪生长激素基因（GH基因）部分序列的多态性进行分析。方法采用内切酶ApaI和Hin6I对西藏小型猪（108头）和广西巴马小型猪（132头）GH基因-119 bp～＋486 bp之间的区域进行PCR-RFLPs分析。结果 （1）从ApaI酶切产生的结果来看,ApaI酶切产生A（449 bp＋101 bp＋55bp）,B（316 bp＋133 bp＋101 bp＋55 bp）两种等位基因。等位基因A的频率高于等位基因B,等位基因A为优势基因。AA基因型频率高于AB和BB基因型频率;（2）从Hin6I酶切产生的结果来看,Hin6I酶切产生G1（605bp）、G2（498 bp＋107 bp）、G3（449 bp＋156 bp）、G4（449 bp＋107 bp＋49 bp）四种等位基因。等位基因G4的频率高于等位基因G1、G2、G3。等位基因G1频率很低。基因型G2G3、G2G4、G3G4、G4G4的频率较高。（3）由酶切产生的基因和基因型多态性,发现西藏小型猪与广西巴马小型猪在该基因部分序列差异不显著（P〉0.05）。结论国内的优质实验用小型猪,如西藏小型猪和广西巴马小型猪等位基因A频率均较高。     

利用DNA改组技术改造aacC1基因启动子活性的研究

从表达质粒pYPX251(GenBank 登陆号：AY178046)中获得aacC1基因启动子,采用DNA改组（DNA shuffling）技术在体外获得突变体。以lacZ作为报告基因,筛选获得活性明显改变的启动子。经过验证,对其中活性变化明显的7个启动子用邻硝基苯基β半乳糖苷(ONPG)作为底物进行表达活性测定。结果表明,获得的强启动子比原来的提高了3～8倍,而弱启动子则活性下降明显,其中3个几乎无活性。进一步对这7个启动子进行了序列分析。     

生长激素基因(GH2)多态性与猪部分生产性能的关系

采用PCR -RFLP对南昌白猪 (117头 )和大约克夏猪 (36 1头 )的GH 2基因 - 119～ +486bp的片段进行了扩增 ,并用ApaⅠ酶切 ,产生了 2个等位基因A(44 9+10 1+5 5bp)和B(316 +133+10 1+5 5bp)。分析了不同基因型对个体初生重、2月龄重、4月龄重、6月龄重、校正背膘厚、平均背膘厚、瘦肉率和料重比等生产性能的影响。结果表明 ,在南昌白猪中 ,不同GH 2基因型间在所测的生产性能上差异不显著 (P >0 0 5 ) ;在大约克夏猪中 ,AA型猪的瘦肉率最低、与BB型猪相比 ,差异显著 (P <0 0 5 )。     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

血痕Chelex 100抽提DNA用于人类TNF-α基因启动子区SNP分型

建立快速、简便的血样本采集及DNA抽提方法,可用于大规模的分子流行病学调查及群体遗传学研究。采用无菌纱布为载体取血,Chelex100快速抽提DNA,用TaqMan MGB探针对人类TNF-α基因启动子区-857（C／T）位点进行SNP分型。344份血样均得到明确的分型结果,获得的荧光信号强,本底低。深圳地区汉族群体-857位点基因型频率分别为：cc为0.78,ct为0.21,tt为0.01。血痕Chelex100抽提DNA为大规模血样本的采集,DNA的抽提提供了有效的手段。     

五指山猪GH、IGFBP3基因SNPs检测及与生长性状的关联分析

以五指山猪为试验材料,采用PCR-SSCP和测序相结合技术,对GH基因和IGFBP3基因进行多态性检测,并分析其与生长性状(体质量,体高,体长和胸围)的相关性。结果表明,GH基因第2外显子存在一处G→A转换,属沉默突变,该位点与生长性状关联分析显示,BB基因型的体重显著高于AA基因型和AB基因型;IGFBP3基因第2外显子存在一处G→C颠换,属沉默突变,该位点与生长性状关联分析显示,AA基因型的体高显著高于BB基因型;IGFBP3基因第4内含子存在一处碱基C缺失,该位点与生长性状关联分析显示,AA基因型体重显著高于AB基因型和BB基因型。研究将为五指山猪生长发育规律、系统选育及矮小机制等方面研究提供了遗传学依据。     

猪HSL基因多态性研究及其部分DNA片段的测序

激素敏感脂肪酶（ＨＳＬ）是动物体脂肪分解的关键酶。采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法研究猪ＨＣＬ基因的启动子区、部分５’－端转录非翻译区,第７外显子区、第８外显子区和３’－端部分转录非翻译区域ＤＮＡ多态性。结果在对应于ＨＳＬ基因第８外显子区域发现１ＤＮＡ片段的ＳＳＣＰ,表现出３种基因型ＭＭ、ＭＮ和ＮＮ,脂肪型猪种梅山猪和通城猪含有更多的等位基因Ｍ（频率分别为０．６８０和０．７４０）,而瘦肉型猪种大白猪和长白猪     

利用DNA池和测序技术快速筛查SNPs及估算基因频率

选取产蛋性能具有明显差异的4个鸡品种(莱航鸡、阳山鸡、丝羽乌骨鸡和隐性白洛克鸡)构建品种DNA池,采用测序的方法研究鸡催乳素基因5′侧翼调控区远端序列(1028bp)的多态性,快速筛查到8个可能与产蛋性能相关的SNPs(C-2402T、T-2192C、C-2161G、C-2134G、C-2062G、G-2040A、A-1944G和C-1884A)。进一步利用测序图中SNP等位基因峰高的比值估算各鸡品种等位基因的频率,其中C-2402T、C-2161G、C-1884A和C-2062G、G-2040A位点等位基因频率的估算结果分别被PCR-RFLP、PCR-SSCP所验证,说明测序峰高比值估算等位基因频率的方法具有一定的可行性。     

已建株鼻咽癌细胞的PLUNC基因启动子区序列多态性分析

目的检测人类标准鼻咽癌细胞中是否存在已知的PLUNC基因启动子-437bp-＋87bp区域的单核苷酸多态性（SNP）。以便进一步探索SNP与鼻咽癌的关系。方法采用PCR产物直接测序的方法,对7株体外培养的鼻咽癌细胞基因组DNA的PLUNC基因启动子区进行序列分析。结果发现7株PLUNC基因的启动子区皆存在已知的3个SNP位点（1888、2128和N2）和未知一个突变位点（N1）,其测观杂合度分别为85．7％、100％、100％和28．6％。其中3个已知SNP位点在筛查的细胞株中均存在T-C的突变,而且SUNE-1鼻咽癌细胞株的1888位点基因型为突变纯合子CC型。结论体外培养的标准鼻咽癌细胞株中存在已知的3个SNP位点（1888、2128和N2）的突变现象,且突变率为100％;1888位点鼻咽癌易患型（CC型）已在体外稳定建株;首次发现启动子-195bp区域N1突变位点。     

人MIF基因启动子多态性与结核病易感性的关系

为了研究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)与结核病易感性的关系,分析了肺结核病人和正常人MIF基因启动子多态性。DNA测序分析的结果显示,正常人MIF基因启动子-794区CATT序列重复次数存在明显的差异,5、6和7个拷贝的几率分别是22.2%、44.4%和33.3%。7个肺结核病人中6人有6个拷贝,1人有7个拷贝,出现的频率分别为85.6%和14.3%。对比分析提示,肺结核病人MIF基因启动子区CATT低拷贝数(低于或等于6个)出现的频率明显高于正常人(85.6%比66.6%),可能同结核病的致病相关。     

猪Pit-1基因第三内含子序列的克隆测序

根据不同物种间同一基因核苷酸序列的保守性及相似性的特点 ,在人和鼠的Pit 1基因第三外显子上设计上游引物 ,而将下游引物设计在猪Pit 1基因第四外显子上。利用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,扩增出猪Pit 1基因第三内含子序列 ,并经由酶切及序列同源性比对确认该序列即为猪Pit 1基因第三内含子序列。此序列的确定为下一步进行遗传变异分析的研究奠定了基础     

云南保山猪线粒体DNA D-loop区序列初步分析 Primary Analysis of Mitochondrial DNA D-loop Region Sequence in Baoshan Pig

摘要：为了解云南保山猪(Baoshan pig)的遗传多样性及其遗传背景,我们测定了19个个体线粒体DNA D-loop高变区I 15 363～15 801片段序列438 bp。检测到10种单倍型,包括8个多态位点,其中5次T/C转换、1次G/A转换、1次G/C颠换和1次A/T颠换,其A、T、G、C碱基的平均含量分别为35.4%、26.9%、13.2%和24.5%,A+T含量(62.3%)明显高于G+C含量(37.7%)。对于保山猪的保种及其持续利用有着重要的理论指导意义。 Abstract:To investigate the genetic diversity and genetic data of Baoshan pig in Yunnan province,the mitochondrial DNA D-loop hypervariable segment I sequences 15 363～15 801 (438 bp) in 19 individuals of Baoshan pig were sequenced.Ten mitochondrial haplotypes were identified in the samples,with 8 sites showing polymorphism,which were 5 T/C and 1 G/A transitions,1 G/C and 1 A/T transversions.The contents of A,T,G and C were 35.4%,269%,13.2% and 24.5%,respectively.The content of A+T (62.3%) was significantly higher than that of G+C (37.3%).It will be of importance to conservation and sustainable utilization in Baoshan pig.     

马铃薯块茎组织特异性启动子的克隆及序列分析

利用PCR技术从马铃薯陇薯3号基因组DNA中扩增出长度约为1.0 kb的DNA片段,经与T载体连接,测序表明,克隆到的DNA片段大小为969 bp,该序列与GenBank中已公布的patatin启动子序列同源性为97.94％;采用植物顺式调控元件数据库PLACE和PlantCare进行序列分析,结果表明,该片段含有启动子的保守序列TATA-box和CAAT-box,且在CAAT-box上游有8 bp的增强子.此外,还具有马铃薯块茎蛋白patatin基因启动子保守调控序列的蔗糖效应元件(SURE)4个及马铃薯储藏物特异结合调控patatin蛋白表达位点(B-box)2个,而这些特异序列可能是基因特异表达所必须的.     

Detection of Genomic Variation by Selection of a 9 Mb DNA Region and High Throughput Sequencing

Detection of the rare polymorphisms and causative mutations of genetic diseases in a targeted genomic area has become a major goal in order to understand genomic and phenotypic variability. We have interrogated repeat-masked regions of 8.9 Mb on human chromosomes 21 (7.8 Mb) and 7 (1.1 Mb) from an individual from the International HapMap Project (NA12872). We have optimized a method of genomic selection for high throughput sequencing. Microarray-based selection and sequencing resulted in 260-fold enrichment, with 41% of reads mapping to the target region. 83% of SNPs in the targeted region had at least 4-fold sequence coverage and 54% at least 15-fold. When assaying HapMap SNPs in NA12872, our sequence genotypes are 91.3% concordant in regions with coverage≥4-fold, and 97.9% concordant in regions with coverage≥15-fold. About 81% of the SNPs recovered with both thresholds are listed in dbSNP. We observed that regions with low sequence coverage occur in close proximity to low-complexity DNA. Validation experiments using Sanger sequencing were performed for 46 SNPs with 15-20 fold coverage, with a confirmation rate of 96%, suggesting that DNA selection provides an accurate and cost-effective method for identifying rare genomic variants.     

野猪及其与家猪杂种猪Myostatin基因3'编码区的克隆和序列分析

Myostatin, which is a highly conservative gene among breeds, is a negative regulator of muscle. The 3' coding region of wild boar and crossbred pig myostatin was cloned by RT - PCR and sequenced. Compared with that of GenBank, the homology of the nucleotide sequence between wild bear and crossbred pig is identical in this region indicating that domestic pigs were evolved from wild boar and there was not changed in this region during the evolution processes.     

绵羊线粒体DNA D-loop区串联重复序列变异研究

对来自69个我国地方绵羊品种和8个国外引入品种共计77个个体线粒体DNA控制区长度为75bp的串联重复序列进行了测序分析。在309个重复序列中检测到28个变异位点,其中7个为具有2个变异体的单现突变,1个为具有3个变异体的单现突变,20个为具有2个变异体的简约位点。由28个变异位点中归纳出63个单倍型,其中单倍型Ⅰ和单倍型Ⅲ具有较高的比例,分别为12．94％和30.42％。研究结果揭示我国地方绵羊可能起源于两个母系祖先。哈萨克羊和阿勒泰羊间以及蒙古羊和乌珠穆沁羊间分别具有较近的亲缘关系且没有明显的遗传分化。藏绵羊、蒙古羊和乌珠穆沁羊相对哈萨克羊和阿勒泰羊而言具有较低的遗传多样性。     

山猪群体钙调蛋白酶抑制蛋白基因遗传变异研究

目的：研究猪钙调蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因在山猪群体的遗传变异情况,为山猪肉质研究奠定基础。方法：应用PCR-SSCP技术和测序方法检测山猪及其杂种猪CAST基因的遗传多态性,并与其他品种猪相应序列进行比较。结果：用pCT1引物在山猪及其杂种群体中检测到2个多态位点（A,B）,用pCT2引物检测到3个多态位点（C,D,E）;序列分析表明,C和E位点共同拥有6处变异。结论：通过与其他猪品种比较,发现山猪的CASTMsp基因型分布与梅山猪的基因型分布完全一样,而与国外品种猪的基因型分布差异明显。