酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae) 基因启动子的分离和鉴定

用启动子探针型载体pFR109从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae)总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖萤酶基因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明：该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时,它仍能启动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去掉Y8片段5’端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。     

人胰岛素基因的合成Ⅷ.表达型质粒的构建和在大肠杆菌内生产含胰岛素原的融合蛋白

我们已构建两组质粒,适合于在大肠杆菌内克隆基因和直接大量咸融合蛋白。这些质粒含有E.coli的lac启动基因和部分编码β-半乳糖苷酶的序列,编厔的蛋白长度约590或450个氨基酸殖基(原基因编码1023个氨基酸殖基)。被缩短的β-半乳糖苷酶基因的末端跟随一个多种限制性酶的接头序列;这个序列可被八种限制性酶中的任一种切断,然后插入任何蛋白基因。每组质粒有三种,可以满足所有三种不同的翻译读框。我们克隆了人工合成的入胰岛素原基因到这些质粒上去,在大肠杜菌内可以生产大量β-半乳糖苷酶残基—人胰岛素原融合蛋白。     

蜂毒溶血肽前体蛋白cDNA的克隆及其融合蛋白的表达

从蜜蜂毒腺中提取总RNA ,通过RT PCR扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的cDNA ,将扩增产物克隆到 pT7Blu T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到 pUC1 1 8载体上 ,构建了重组质粒pUMP。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的cDNA序列与所发表序列完全相同 ,且与 β 半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框。含重组质粒 pUMP的大肠杆菌DH5α表达了与β 半乳糖苷酶部分序列融合的蜂毒溶血肽前体蛋白     

几种固氮菌nifA基因片段的同源性分析

参照已知数种固氮菌nifA基因的DNA序列,选择其中间区域的两个保守性较强的序列合成引物,利用肺炎克匠杆菌(Klebsiella pneumoniaef)、棕色固氮菌(Azotobacter vinela-ndii)、巴西固氮螺菌(Azospirllum brasilense)、草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)和深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的总DNA进行聚合酶链反应,结果均扩增出约450bp大小的片段,经证实为各种固氮菌的nifA基因部分片段。 核酸印迹分子杂交结果显示出nifA基因在不同固氮菌中的同源性不强。     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

青霉素G酰化酶(PA)操纵子的调节基因(pacR)存在于青霉素G酰化酶结构基因(pac)内部Dral-Taql一段约500bp的DNA片段内,此片段内含有2个ORF。2个ORF及其突变体分别克隆到pUC18得到一系列重组质粒,用这些重组质粒转化青霉素G酰化酶产生菌E.coliD816,测定克隆片段对PA表达的影响。如果克隆片段含有具功能的pacR,诱导剂苯乙酸(PAA)不能使由高拷贝却pacR表达的阻抑物全部失活,部分阻抑物结合pac操纵基因,阻碍RNA聚合酶对pac的转录,因此PA的表达量降低。结果表明,阻抑物是由pac结构基因内部的ORF2编码的蛋白因子,pacR即ORF2。RNA—DNA杂交实验证实了pacR在转录水平阻抑pac的表达。     

海枣曲霉产生的糖苷酶类

以木聚糖酶、β-D-岩藻糖苷酶活力较高的海枣曲霉作为试验菌株。该菌株的粗酶液含有多种糖苷酶,活力较高的有木聚糖酶、地衣多糖酶、β-木糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶及β-半乳糖苷酶等。其β-D-岩藻糖苷酶活力还高于β-半乳糖苷酶。将海枣曲霉培养不同时间后测活力,表明木聚糖酶在培养的第2天即大量产生,第3天达到高峰。Β-D-岩藻糖苷酶在第4天开     

反向PCR方法克隆腾冲嗜酸两面菌的分子伴侣基因*

根据已知的Sulfolobus属的分子伴侣基因,设计简并引物,用PCR的方法从腾冲嗜酸两面菌(Acidianus tengchongensis)基因组DNA中分别克隆到了分子伴侣α亚基和β亚基的约500bp的基因片段。以它们为探针进行Southern杂交,确定了合适的限制性内切酶。以确定的限制性内切酶消化的基因组DNA环化物为模板,进行反向PCR反应,引物的延伸方向由已知序列出发沿环化分子向未知区域进行,扩增产物经测序表明为α亚基和β亚基基因。根据所得序列分别设计两对引物进行PCR,测序结果     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K的基因克隆和序列分析

利用PCR方法 ,分别扩增牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K (KGP)的催化结构域 (KGPcd)和凝集素结构域 (KGP-hag)的基因片段 ,将基因片段插入pGEM-T easyVector,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定, KGPcd和KGP hag的序列与国外文献报道一致。克隆到牙龈卟啉菌KGP的KGPcd和KGP hag基因 ,为体外表达其活性蛋白奠定了基础。     

应用CTB基因启动子及信号肽序列构建分泌性表达系统

利用霍乱毒素B亚基基因的启动子、信号肽序列及ctx操纵子的转录终止信号构建了分泌性表达的质粒载体pMCOSS。Β－半乳糖苷酶基因克隆至霍乱毒素B亚基基因的信号肽序列下游后能得到高效分泌性表达。不同的宿主菌和培养基成分中对β-半乳糖苷酶的表达产量有较大的影响,以MM2为宿主菌、在玉米浆培养基中β－半乳糖苷酶的表达产量达4 lOOu／ml,产物的大部分分泌至细胞的周质,活力测定的结果与SDS—PAGE电泳测定结果基本一致,说明表达的β－半乳糖苷酶绝大部分都具有酶活性。构建的蛋白质分泌性表达的载体－宿主系统及合适的培养条件为易形成包含体的蛋白质的高效表达提供了一条新的途径。