酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株AS21416中分离纯化出总RNA和mRNA,以AMV逆转录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有1507个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达99.6%。利用BamHⅠ和SacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。     

植物海藻糖-6-磷酸合成酶基因研究进展

海藻糖-6-磷酸代谢通路是植物响应非生物胁迫生理调控网络中的重要组成部分,海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS（Trehalose-6-phosphate synthase）是植物合成海藻糖的关键基因。为了更加充分地理解TPS基因在植物应答非生物胁迫、调节开花时间等方面的作用,本文首先对植物TPS基因家族成员的系统进化关系及序列结构信息进行了研究,重点论述了TPS基因在植物响应干旱、盐害、高温、低温胁迫中的调控功能及分子作用机制,最后对TPS基因参与植物开花调控的研究进展进行了综述。本文深入总结了目前植物TPS基因响应非生物胁迫及开花调控的研究进展,并对今后TPS同源基因的研究方向和应用价值进行了展望。     

酿酒酵母海藻糖—６—磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株ＡＳ２．１４１６中分离纯化出总ＲＮＡ和mRNA,以ＡＭＶ逆录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有１５０７个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达９９．６５。利用ＢamＨⅠSacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。     

条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因全长cDNA的电子克隆

利用日本DDBJ数据库电子克隆了条斑紫菜的6-磷酸海藻糖合成酶基因（pytps）,得到全长cDNA序列2727bp;经过ORF finder分析,获得了相应蛋白质的全长序列908Aa,分子量约为101．8kD。将条斑紫菜的6-磷酸海藻糖合成酶与多种模式生物大肠杆菌、裂殖酵母、拟南芥、水稻、秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇的同源蛋白进行序列比对得到了聚类分析图表明它们之间具有一定的进化相关性功能结构域预测分析显示PyTPS拥有两个功能结构域Glyco．transf 20 domain和Trehalose．PPase domain,这对于进一步分析蛋白质结构与功能的关系将有很大的启示。     

垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆及功能分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthse, TPS)是植物海藻糖合成途径的关键酶, 在旱生卷柏等复苏植物对逆境胁迫应答中起重要作用。文章以我国特有旱生植物垫状卷柏(Selaginella pulvinata)为材料, 采用同源扩增与RACE技术相结合的方法克隆了海藻糖-6-磷酸合成酶基因SpTPS1, cDNA全长3 223 bp, 包括一个2 790 bp的开放阅读框, 推导的氨基酸序列与模式物种的海藻糖-6-磷酸合成酶具有较高的序列相似性, 催化活性中心保守位点基本一致。酵母功能互补实验证明, 用SpTPS1基因开放阅读框转化的海藻糖合成酶基因突变(tps1△)酵母菌株, 可恢复在以葡萄糖作为唯一碳源培养基上的生长, 说明垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因SpTPS1的编码蛋白具有生物活性, 可应用于植物抗逆性的转基因改良。     

昆虫海藻糖及其合成酶基因的特性与功能研究进展

海藻糖广泛存在于细菌、真菌、昆虫、无脊椎动物和植物等大量生物中。它不仅可以作为昆虫的能量来源,而且在抗逆等方面起着重要作用。海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成过程中的一个关键酶。目前细菌、真菌和植物中都已经被发现和克隆,但其不存在于哺乳动物中。海藻糖是昆虫的\"血糖\",主要通过海藻糖合成酶和海藻糖-6-磷酸脂酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)在脂肪体中催化合成。TPS基因所编码的蛋白序列一般都包含两个保守的结构域:TPS和TPP,分别对应着酵母中的Ots A和Ots B基因。昆虫海藻糖合成酶的基因表达和酶活性的变化与昆虫的多项生理过程有着密切的关系,海藻糖合成酶有可能成为控制害虫的新靶标。     

葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、序列分析及滞育相关表达

海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）是昆虫海藻糖合成途径中的关键酶之一。本研究通过对葱蝇Delia antiqua海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆、 序列分析及滞育相关表达的分析, 旨在证明该基因在能源合成以及抵御高温和低温环境方面发挥重要作用, 为进一步弄清葱蝇滞育分子机制提供理论依据。根据葱蝇抑制消减杂交文库中的EST序列信息, 设计特异性引物, 并通过RACE技术克隆了葱蝇海藻糖-6-磷酸合成酶基因全长cDNA, 命名为DaTPS1 （GenBank登录号： JX681124）, 其全长为2 904 bp, 开放阅读框2 448 bp, 编码815个氨基酸, 推测其相对分子质量为91.2 kD, 等电点为5.96。生物信息学分析表明, 该基因编码的氨基酸序列具有两个保守结构域, 与其他物种TPS具有较高的同源性, 其中和黑腹果蝇Drosophila melanogaster亲缘关系最近, 氨基酸序列一致性为92.1%; 其蛋白质三维结构有15条大的α螺旋和11股反向平行的β链折叠。RT-PCR分析表明, DaTPS1在葱蝇非滞育、 夏滞育和冬滞育期蛹中都有表达, 但是非滞育期各时期表达量基本没有变化, 而在夏滞育和冬滞育蛹的滞育前期表达量较高, 滞育保持期表达量较低, 滞育期后期表达量又有所升高。推断在葱蝇蛹夏滞育和冬滞育期前期, TPS1开始催化合成较多的海藻糖以提高滞育期抵御不良环境的能力, 滞育保持期蛹的新陈代谢降低, 所需能量较少, 所以TPS1处于低水平表达状态, 而滞育期结束后, 蛹生长发育逐渐恢复, 所需能量有所增加, TPS1的表达量再次升高。本研究对揭示昆虫TPS在能量代谢通路中的作用及昆虫滞育的分子机理具有一定的科学意义。     

灰树花海藻糖合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

海藻糖主要作用是作为生物体的结构组分、以及保护生物膜和保护蛋白质。在灰树花中 ,海藻糖在干重中所占比例最高可达到 1 5 %～ 1 7% ,说明灰树花合成海藻糖的能力很强。将灰树花海藻糖合成酶基因克隆 ,并在大肠杆菌表达系统里表达。表达量为 1 90mg L。通过活性测定 ,证明在大肠杆菌中表达的海藻糖合成酶具有酶活性 ,结合基因工程和酶工程方法 ,为合成海藻糖的研究提供了新的方向     

甜瓜HDM基因家族鉴定及特性分析

组蛋白去甲基化酶(histone demethylase;HDM)是生物生长过程中的重要调节因子之一;在植物的生长发育和环境适应过程中发挥着重要的调控作用。本研究通过生物信息学方法对甜瓜(Cucumis melo L.) HDM基因家族进行了鉴定;并通过转录组数据检测了其成员在甜瓜组织的表达特性。结果显示;在甜瓜基因组中鉴定得到了20个CmHDM基因;在各条染色体上非均匀分布;其成员可以分成LSD1和JmjC两大类;而JmjC类群又可划分为5个亚群;各类群成员数量不等;种内和种间的共线性关系显示;甜瓜HDM基因仅存在一对片段重复;与番茄(Solanum lycopersicum) HDM基因共线性区域较多;亲缘关系较近;各成员所含保守结构域数量不等;且外显子和内含子在数量上有所差异;在启动子区域存在多种与激素和环境信号响应的顺式作用元件;表达特性分析显示各基因成员在甜瓜雄花、雌花、根、茎、叶、子房和成熟果实中均存在不同程度的表达。这些结果将有助于更好地理解HDM基因的潜在功能以及它们在参与调节甜瓜生长发育和环境自适中可能发挥的作用。     

辣椒GASA基因家族的鉴定及分析

目的 研究辣椒（Capsicum annuum L.）GASA的基因结构和表达分析;为阐明CaGASA基因的生物学功能及进一步培育抗逆性强的辣椒品种提供参考。 方法 运用生物信息学方法对辣椒8个GASA进行鉴定;并分析它们的理化性质、系统发育关系、基因结构、保守基序、染色体位置、蛋白互作网络、基因同源性和启动子区域等;实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR）验证辣椒GASA基因家族成员在不同组织、非生物胁迫和激素处理下的表达模式。 结果 8个CaGASA在辣椒5条染色体上不均匀分布;所有CaGASA蛋白都有一个共同的结构域GASA;亚细胞定位预测结果表明;CaGASA蛋白存在于细胞外区域;辣椒、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum L.）、水稻（Oryza sativa L.）基因组的直系同源GASA基因共线性分析结果表明;辣椒与其他3个物种之间有14个共线性事件;CaGASA5与3个物种的GASA基因均具有共线性;顺式元件分析表明;GASA基因可能受到多种植物激素和胁迫的诱导;转录组数据分析显示;CaGASA在辣椒花和果实中的表达水平高于叶;RT-qPCR分析表明;CaGASA基因响应低温、高温胁迫和脱落酸（abscisic acid, ABA）、赤霉素（gibberellin, GA）、吲哚乙酸（indole acetic acid, IAA）和茉莉酸（jasmonic acid, MeJA）激素处理。 结论 辣椒GASA基因家族可能参与辣椒花发育;响应激素和耐高、低温胁迫的应答。     

新疆甜瓜Fom-2基因同源序列的克隆及分析

近年来甜瓜枯萎病蔓延迅速,危害严重,分离克隆甜瓜抗病基因,利用转基因技术改良甜瓜抗病品性是一种从根本上解决甜瓜枯萎病危害的新途径。根据已知Fom-2基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术从新疆甜瓜抗病性品种黄旦子中扩增出580bp的cDNA片段,序列分析表明它与已发表Fom-2基因具有高度同源性基因片段,命名为X-Fom-2。以X-Fom-2为探针对新疆甜瓜黄旦子、伽什瓜、红心脆、金丽-2号进行Southem blot和Northem blot,结果表明,X-Fom-2以多拷贝形式存在。X-Fom-2在抗病品种黄旦子、金丽2号有表达且在病原菌诱导后增强,而在感病品种伽什瓜、红心脆中没有表达。     

厚朴萜类合酶基因家族鉴定及表达模式分析

萜类合酶(TPS)是合成萜类物质的关键酶,可以催化同一萜类前体物质形成不同的萜类骨架,也可以作用于多种底物,从而产生多样的萜类化合物。该研究通过生物信息学方法对厚朴MoTPS基因家族成员进行鉴定,并综合分析其理化性质、染色体定位、系统进化关系、保守基序、基因结构和顺式作用元件等,基于厚朴根、茎、叶、果实及不同发育时期厚朴花转录组数据,分析其在厚朴不同部位及不同时期厚朴花中的组织特异性及表达模式。结果表明:(1)在厚朴中共鉴定出55个MoTPS家族成员且47个成员分布在10条染色体上。(2)保守基序及基因结构分析表明,MoTPS蛋白属于Class ⅠTPS,基序数量在1～11个之间且所有成员均包含典型的TPS保守基序,但不同MoTPS基因的内含子数量差异较大。(3)系统进化分析表明,MoTPS 共分为5个亚家族,其中TPS-a亚家族成员占比最高,为58.18%。(4)顺式作用元件分析表明,启动子区域包括光响应、激素调节、环境胁迫、植物生长发育、代谢等顺式作用元件,MoTPS基因在厚朴不同部位及不同发育时期厚朴花中的表达量存在显著性差异, 表明MoTPS基因在厚朴各部位及不同花期可能存在功能的分化。该研究结果为深入探究厚朴MoTPS基因的功能,以及解析其在厚朴花香气物质生物合成和调控机制中的作用奠定了基础。     

酿酒酵母海藻糖合成酶基因的克隆和在大肠村菌中的表达

用PCR方法克隆了1．5kb的酿酒母Sacchromyces cerevisiae海藻糖合成酶基因TPSI,将该片段连接到pUC19载体,通过转化分别引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大肠杆菌Escherichia coli FF4169 和FF4050,对转化株的质粒DNA酶切分析表明均含有1．5kb PCR克隆片段,生长曲线实验证明,带有克隆片段的转化株在含0．5mol/L NaCl的高渗透压基础培养基中生长良好;用高效液相色谱（HPLC）结合蒸发散射（ELSD）技术测定细胞内海藻糖实验证明转化株能够合成海藻糖。     

枸杞SWEET基因家族的鉴定与糖含量关系分析

【目的】糖外排转运蛋白（sugars will eventually be exported transporters, SWEETs）在植物生长发育过程中发挥重要作用,为解析SWEETs基因在枸杞（Lycium barbarum L.）果实发育过程中对糖积累作用,进一步为揭示SWEET基因在枸杞果实发育过程中作用提供参考。【方法】研究基于枸杞基因组数据,采用生物信息学方法对枸杞SWEET基因（LbaSWEET）进行全基因组鉴定,并利用已发表的转录数据分析了LbaSWEETs在果实发育时期的基因表达情况。【结果】结果表明,枸杞SWEET基因家族共有37个成员,随机分布于10条染色体上,分别编码152~621个氨基酸,蛋白质分子量为16.87~69.97 kD,等电点为4.96~9.86。亚细胞定位预测位于叶绿体或质膜,大多数含有7个跨膜螺旋。系统进化分析发现,37个LbaSWEET蛋白可分为4个亚群,每个亚群的基因结构和保守基序组成相似。启动子元件分析发现,LbaSWEET基因启动子富含大量激素响应、逆境胁迫和生长发育响应元件。转录组数据和qRT-PCR分析表明,LbaSWEET9和LbaSWEET29基因表达量随着果实成熟呈现显著增加。相关性分析结果表明,LbaSWEET9和LbaSWEET29基因表达量与果糖含量呈显著正相关。【结论】研究推测LbaSWEET9和LbaSWEET29基因是果糖积累的关键基因。     

松材线虫TAX家族基因结构与表达模式分析

【目的】本研究旨在通过对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus TAX家族成员的理化性质、结构和功能及药物和低温胁迫后的TAX家族基因Bx-taxs表达情况进行分析;探究松材线虫化学趋性和温度趋性。【方法】基于NCBI数据库调取秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的TAX家族基因序列与松材线虫基因组进行tBlastn比对搜索;调取松材线虫TAX家族候选基因。通过ExPASy, WoLF PSORT, SOPMA, Alphafold 3, MEME, CD-Search和TBtools等软件和在线工具对候选序列进行筛选和清洗;鉴定松材线虫Bx-taxs并分析基因结构和染色体定位及其蛋白的亚细胞定位、序列特征、理化性质、二级结构和三级结构。利用IQtree构建TAX家族蛋白序列系统发育树推断亲缘进化关系。对松材线虫在甲维盐药物胁迫和低温胁迫下6个Bx-tax的表达谱进行分析;确定TAX家族成员在响应外界胁迫中的作用。【结果】共鉴定出6个松材线虫TAX家族成员Bx-TAX-1-6; 这些蛋白长度为623-1 115个氨基酸残基;相对分子质量为71.49-129.27 kD;理论等电点在5.68-9.04之间;多数为亲水性蛋白。6个TAX家族成员均位于细胞膜上;特别地是Bx-TAX-1还分布于细胞质中。TAX家族蛋白的二级结构以α-螺旋与无规则卷曲为主要组成部分;占比分别为42.10%-53.07%与32.38%-45.80%。染色体定位和系统发育分析表明;松材线虫TAX家族基因共分布于4个染色体上;其中除了Bx-TAX-1基因单独为一个分支;其他TAX基因与线虫的TAX-4基因更为接近。在甲维盐胁迫下;12 h内松材线虫TAX家族成员基因均出现了不同程度的表达下调的现象;在24 h时均出现了不同程度的表达上调的现象;其中Bx-tax-3; Bx-tax-5和Bx-tax-6的表达量上调或下调均超过1倍;在低温胁迫下;仅有Bx-tax-5上调;其他基因均为下调。【结论】松材线虫TAX家族基因对甲维盐和低温胁迫表现出不同程度的响应。本研究结果为基于TAX家族开展的化学和温度趋性研究提供了理论依据;为研究松材线虫响应药剂胁迫和北迁机制提供基础。     

辣椒ARF基因家族的鉴定与表达分析

为进一步研究辣椒ARF(Auxin Response Factor)基因家族在其生长发育及逆境胁迫中的作用,利用生物信息学方法从辣椒基因组中鉴定出20个ARF基因,这些基因不均匀地分布在辣椒12条染色体上。进化关系显示辣椒ARF基因可分为ClassⅠ和Ⅱ两大类,进一步可细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅱa和Ⅱb等7个亚类。基因结构图表明,该基因家族由1~15个外显子构成,且各基因在不同发育时期不同组织中的表达量不同,具有一定的特异性。qRT-PCR结果表明,高盐胁迫可以明显激活或抑制ARF基因家族的表达。     

马铃薯HXK基因家族鉴定及表达特征分析

为探究马铃薯HXK家族的功能,本研究利用生物信息学方法,对马铃薯HXK基因家族成员进行鉴定,并采用实时荧光定量PCR对该基因在不同模拟逆境胁迫下的表达进行分析。研究利用同源比对方法从马铃薯基因组中鉴定获得到6个马铃薯HXK基因,分别命名为StHXK1-StHXK6。该家族基因分别分布于马铃薯的6条染色体上,其编码蛋白长度为497~533 aa,等电点为5.36~6.11,分子质量在53 736.38~58 184.71 Da,均为亲水蛋白。亚细胞定位预测表明,StHXK家族成员主要在叶绿体中表达。该家族成员二级结构均以α-螺旋和不规则卷曲为主,三级结构高度相似。顺势元件分析发现马铃薯HXK基因主要包含光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件及生长发育相关元件。qRT- PCR结果表明,StHXK基因在ABA诱导下均上调表达显著,50 μmol/L ABA胁迫下,StHXK1和StHXK2在处理24 h相对表达量较高,分别为对照的286.4倍和152.02倍,200 mmol/L NaCl处理下,除StHXK1和StHXK4基因相对表达量在处理时间2 h呈上调表达,其余StHXK基因均呈不同程度的下调表达。在10% PEG胁迫处理下,StHXK基因相对表达量呈不同程度的上调表达。综上所述,StHXK基因对ABA、NaCl和PEG胁迫处理均存在不同程度的响应。